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一．化学符号及其周围数字的意义分别是指元素符号、化学式和离子符号等及其周围的四种数字所表示的含义．具体内容如下：
1、元素符号宏观上表示元素，微观上表示该元素的一个原子．另外，还有一种特殊情况；那就是，部分元素符号还能表示由它所组成的物质等；
2、化学式宏观上表示物质及其组成，微观上表示该物质的构成．如果构成该物质的粒子是原子，那么它还能表示元素和一个该原子；如果构成该物质的粒子是分子，它除了表示一个该分子外，还表示该分子的构成；
3、离子符号整体上表示一个该离子，右上角表示一个该离子带几个单位的正或负电荷．
4、四种数字的含义是这样的：（1）化学符号前面的数字，表示微粒的个数．（2）化学符号右下角的数字，表示一个该微粒中所含该原子的数目．（3）化学符号右上角的数字，表示一个该离子所带的电荷数．（4）化学符号正上方的数字，表示在该化合物里该元素或原子团所显的化合价．
1.下列化学用语所表达的意义正确的是（
）
A．2K﹣﹣2个钾元素
B．Al3+﹣﹣1个铝离子
C．O3﹣﹣3个氧原子
D．2N﹣﹣2个氮分子
2.下列化学用语书写正确的是（
）
A．氦气：He2
B．两个金原子：2AU
C．铝离子：Cl﹣
D．硫酸铁：Fe2（SO4）3
3.下列化学用语书写正确的是（
）
A．两个氮原子：2N2
B．两个氢分子：2H
C．氧化铝的化学式：Al2O3
D．一个钙离子：Ca﹣2
4.下列化学用语正确的是（
）
A．二个氮分子﹣﹣﹣﹣2N
B．氦气﹣﹣﹣﹣He2
C．二硫化碳﹣﹣﹣CS2
D．锌离子﹣﹣﹣Zn+2
5.对下列化学用语中数字“2”的说法正确的是（
）
①2N
②2NH3③2OH﹣④SO2⑤H2O
⑥Mg2+
A．表示离子个数的是⑥
B．表示离子所带电荷数的是③
C．表示分子中原子个数的是④⑤
D．表示分子个数的是①②
6.下列各组选项中数字“2”的含义相同的一组是（
）
A．O2和2O
B．Cl2和Cu2+
C．3O2和SO2
D．2H2SO4
7.下列化学符号中数字“2”表示的意义，正确的是（
）
A．SO2表示二氧化硫中含有2个氧原子
B．2CO﹣﹣两个一氧化碳分子
C．Ca+2﹣﹣一个钙离子带两个单位正电荷
D．2Fe：表示2个铁元素
8.对于下列几种化学符号，有关说法正确的是（
）
①Fe②③N④OH﹣⑤CaCO3⑥H2O2
A．表示物质组成的化学式有①③⑤⑧
B．④⑤⑥中都含氧元素，其中氧元素的化合价均为﹣2价
C．表示阴离子的有②④，且它们都带有一个单位的负电荷
D．①③符号有三层意义：表示一种单质、一种元素和一个原子
9．下列各种符号所表示的意义最多的是（
）
A．H
B．2N
C．Na
D．2O2
10．下列化学用语的使用及其表示的意义，正确的是（
）
A．Ca+2：1个钙离子带2个单位正电荷
B．2K：2个钾元素
C．4SO3：4个三氧化硫分子
D．N2：1个氮原子
11．对下列化学用语中数字“2”的说法正确的是（
）
①2N
②2NH3③2OH﹣④SO2⑤H2O
⑥Mg2+
A．表示离子个数的是⑥
B．表示离子所带电荷数的是③
C．表示分子中原子个数的是④⑤
D．表示分子个数的是①②
12．对下列化学用语中数字“2”含义的说法正确的是（
）
①2CO②2NH3③2N④SO42﹣⑤⑥2H+⑦SO2
A．表示分子个数的是①②
B．表示离子所带电荷数的是④⑤
C．表示离子个数的是④⑥
D．表示分子中原子个数的是③⑦
13．下列化学用语书写错误的是（
）
A．氮元素﹣﹣﹣﹣﹣N
B．氧化铁﹣﹣﹣﹣﹣Fe2O3
C．氢分子﹣﹣﹣﹣﹣H2
D．硫离子﹣﹣﹣﹣﹣S﹣2
14．化学用语是化学学习的重要组成部分，下列对化学用语的说明中，不正确的是（
）
A．2SO42﹣：表示两个硫酸根离子带两个单位的负电荷
B．Na：表示钠元素，表示钠这种金属，表示一个
Na
原子
C．2H：表示
2
个氢原子
D．He：表示氦元素，表示氦气这种气体，表示一个氦原子
15．下列化学符号中数字“2”表示的意义正确的是（
）
A．2H：两个氢元素
B．CO2：一个二氧化碳分子中含有两个氧原子
C．S2﹣：硫元素的化合价为负二价
D．：一个镁离子带有两个单位正电荷
16．下列化学符号中数字“2”表示的意义正确的是（
）
A．Zn2+：一个锌离子带2个单位正电荷
B．SO2：二氧化硫中含有两个氧原子
C．2H：2个氢元素
D．：氧化钙的化合价为+2价
17．下列有关化学用语表示正确的是（
）
A．钙离子：Ca+2
B．2个氧分子：2O
C．氯化亚铁中铁显+2价：Cl2
D．铝原子结构示意图：
18．下面关于“2”的含义的解释中，正确的是（
）
A．Zn2+中的“2+”表示锌元素显正2价
B．2NO中的“2”表示2个一氧化氮分子
C．2S中的“2”表示二个硫元素
D．Fe2+中的“2”表示每个铁离子带两个单位的正电荷
答案：
1-5
BDCCC
6-10
CBCCC
11-15
CADAB
【关键词】 高血压 趋化因子 单核细胞 基因表达 逆转录聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定
原发性高血压（essential hypertension，EH）是常见的心血管疾病，也是导致心脑血管疾病的重要危险因素。近年来，越来越多的学者认为EH是一种与遗传、环境、代谢极为相关的复杂疾病[1～3]，当EH与其他相关危险因素并存时，单纯的血压控制只能使不到60%的患者获益，而危险因素的干预才能获得更大的益处。因此，积极探讨EH的发病机制及其影响因素，对更有效的控制EH，减轻其危害已成为医务工作者的共识。有学者研究发现，炎症可能在EH的发病机制中起着重要的作用[4]，2007年2月～12月实验检测EH患者外周血单核细胞趋化因子1（monocyte chemotactic protein1，MCP1）蛋白水平及单个核细胞MCP1 mRNA的表达，探讨外周血MCP1的变化与EH的关系。
1 对象与方法
1.1 对象及分组
按《中国高血压防治指南（2005年修订版）》[5]制定的标准，选取心血管科住院和门诊新诊断或未经正规降压治疗的EH患者62例，同时选取血压正常的30例健康体检者作为对照组。排除继发性高血压、血栓出血性疾病、糖尿病、高脂血症、感染、严重肝肾疾病、自身免疫性疾病及肿瘤性疾病，排除近期有手术或外伤史等影响MCP1的因素。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂和仪器 人淋巴细胞分离液（上海捷瑞），Trizol试剂（美国Invitrogen），焦炭酸二乙酯（瑞兴），逆转录试剂盒（Promega），PCR试剂盒（Promega），100 bp DNA Ladder Marker、D2000 DNA Marker（天根生化），人MCP1 ELISA 试剂盒（美国R＆D公司）；ULT13863三洋-80 ℃低温冰箱(日本)，5745台式冷冻离心机(德国)，Eppendorff centrifuge 5810R 高速离心机，Amersham核酸蛋白分析仪，PCR仪（PE geneAmp PCR System 2400）（Perkin Elmer），DNA成像分析仪（Gel Doc EQ，BioRad），酶标仪（ELx800，BioTek公司）。MCP1引物设计由上海生工合成，上游引物5' AGGAAGATCTCAGTGCAGAGG 3'，下游引物5' – AGTCTTCGGAGTTTGGGTTTG 3'；βaction：上游引物5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT 3'，下游引物5'GGGCACGAAGGCTCATCATT 3'。
1.2.2 标本采集 受检者空腹12 h，于次日清晨6∶00～7∶00采集肘正中静脉血8 ml，其中4 ml置普通生化管中，室温静置2 h，自然凝固后予离心10 min，1 000 r/min收集上清液置于-80℃冰箱保存待测；另4 ml置于EDTA抗凝试管中摇匀后即刻置40 ℃冰箱冷存，于6 h内提取RNA用。
1.2.3 外周血MCP1蛋白含量测定 用保存待测的血清，依照MCP1 ELISA试剂盒说明书的步骤操作。用酶标仪检测450 nm波长下各孔吸光度，根据吸光度值计算标本中MCP1的浓度。
1.2.4 人血单个核细胞中RNA提取和逆转录聚合酶链反应（RTPCR） 淋巴细胞分离液提取外周血中单个核细胞后，按照说明书的步骤提取总RNA；按逆转录试剂盒说明书步骤合成cDNA，并用PCR技术扩增目的片段，PCR产物用1.5% 琼脂糖凝胶跑电泳，溴乙锭显色。测定各条带灰度值，以βactin为内参，用MCP1与βactin的灰度比值定量MCP1。
1.2.5 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件进行数据分析处理，数据以（x±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。
2 结果
2.1 一般资料
EH组及对照组的一般资料见表1。两组研究对象的年龄、性别、总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、总胆固醇、空腹血糖和外周血白细胞比较，无统计学差异。表1 EH组及对照组的基本资料注：TC示总胆固醇，TG示甘油三酯，FBG示空腹血糖，LDL示低密度脂蛋白，HDL示高密度脂蛋白，WBC示白细胞。
2.2 MCP1水平及MCP1 mRNA表达
见表2。与对照组比较，EH组外周血MCP1蛋白水平及单个核细胞MCP1mRNA表达均显著增高（P＜0.01)。表2 外周血MCP1水平及单个核细胞MCP1mRNA表达注：（1）与对照组比较， P＜0.01。
3 讨论
EH是最常见的心血管疾病之一。传统观念认为，EH是多种因素引起的血液流变学异常，表现为心搏出量和（或）外周阻力增加，治疗目标也仅限于用药物控制血压。随着对EH发病机制的深入研究，发现在EH发生发展的不同阶段，血管炎症是一个主要的、共同的病理特征，提示EH与炎症关系密切[6]。
MCP1为碱性蛋白，属于趋化因子超家族，可由炎症介质刺激的单核-巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、内皮细胞及平滑肌细胞分泌。MCP1在体内及体外均有强大的诱导单核-巨噬细胞聚集、附壁、游走的功能，是炎症的始动因子及标志[7]。研究发现，原发性高血压患者外周血MCP1蛋白含量升高，认为EH可能是一种慢性炎症过程[8]。本研究显示，EH患者外周血MCP1蛋白水平显著升高，提示MCP1可能参与了EH的病理生理过程。因此，积极探索控制炎症的方法可能是高血压乃至冠心病具有前景的治疗策略之一。
EH患者外周血MCP1升高的机制尚不十分明了，可能来源于与内皮细胞、血管平滑肌细胞等上调表达MCP1 mRNA有关，但外周血MCP1蛋白的升高是否与外周血单个核细胞中MCP1 mRNA表达上调有关尚未见报道。本研究显示，与对照组比较，单纯EH组外周血单个核细胞中MCP1 mRNA表达显著增高，提示外周血单个核细胞的MCP1 mRNA表达上调可能是导致EH患者外周血MCP1蛋白含量升高的一个因素，但是否与内皮细胞等其它因素有关，需进一步实验证实。由于MCP1蛋白可能进一步激活CCR2趋化因子受体，介导趋化活性，使单核细胞和巨噬细胞发生移行，黏附于血管内皮细胞，进一步损伤血管内皮[9]，使其产生更多的炎症因子，加速血管重构，使血管壁顺应性下降，从而使血压升高。因此，针对炎症的治疗，或许对控制血压有一定意义。
参考文献
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[关键词] 单核细胞；血小板；肝硬化
[中图分类号] R575.2 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2015）05（c）-0106-03
[Abstract] Objective To explore the changes and clinical significance of parameters of peripheral blood platelets and parameters of monocytes for patients with liver cirrhosis. Methods 50 patients with liver cirrhosis in our hospital from October 2013 to October 2014 were selected as the observation group.The level of PLT，P-LCR，MPV，PDW，PCT，percentage of monocytes and total number of monocytes in the observation group were tested via fully automatic hematology analyzer，and which was compared with that in the control group of 52 subjects with normal results of clinical physical examination. Results The level of PCT and PLT in the observation group was lower than that in the control group，with significant difference（P
[Key words] Monocytes；Blood platelets；Liver cirrhosis
肝硬化是一种或多种致病因素长期或反复损害肝脏所致的肝细胞纤维化性疾病。肝脏是凝血因子合成的主要场所，对于机体的止、凝血功能起着重要作用，当肝硬化发生后，肝细胞大量受损，导致纤溶功能和凝血异常[1-3]。本研究选取本院的肝硬化患者作为研究对象，采用全自动血液分析仪对其血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血小板压积（PCT）、血小板体积分布宽度（PDW）、大血小板比率（P-LCR）、单核细胞百分比、单核细胞总数等进行检测，并与临床体检正常的对照组进行比较，旨在探讨肝硬化患者外周血血小板参数和单核细胞参数的变化及临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取本院2013年10月～2014年10月收治的50例肝硬化患者作为观察组，其中女12例，男38例；年龄30～75岁，平均（44.73±5.56）岁；根据Child-Pugh分级标准分为肝功能A级组（26例）、B级组（16例）、C级组（8例）。同时选取52名临床体检正常且肝功能、血常规检查无任何异常的健康者作为对照组，其中女14例，男38例；年龄31～76岁，平均（45.33±4.86）岁。两组的性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法
使用专用抗凝管采集所有受试者的静脉血2 ml，所有血液标本采用XN-1000全自动血液分析仪的体积（V）、激光散射（S）、高频传导（C）技术及其配套试剂检测PLT、MPV、PCT、PDW、P-LCR、单核细胞百分比、单核细胞总数等各参数值，所有标本2 h内检测完毕。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0统计学软件对数据进行分析，计量资料以x±s表示，采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P
2 结果
2.1 两组血小板参数的比较
观察组的PCT、PLT水平显著低于对照组，差异有统计学意义（P
2.2 两组单核细胞参数的比较
两组的单核细胞百分比和单核细胞总数比较，差异无统计学意义（P>0.05）（表2）。
3 讨论
肝脏是机体的主要代谢器官，能够调节机体的抗凝血及血浆纤维蛋白原（FIB）溶解系统、凝血的相互作用与动态平衡，进而保持凝血系统的完整性[4]。肝硬化发生后期，患者会表现出凝血系统和免疫功能的损害[5-6]，而PLT参与机体凝血，单核细胞则参与机体免疫功能。有效预测肝脏的损伤程度对疾病的诊断、控制治疗都有着非常重要的作用。
本研究采用全自动血液分析仪对肝硬化患者的外周血PLT参数和单核细胞参数进行检测，并与52名临床体检正常的对照组进行比较，结果显示，观察组的PCT、PLT水平显著低于正常健康者，差异有统计学意义（P
综上所述，肝硬化患者外周血单核细胞百分比和单核细胞总数变化不明显，但PLT参数较正常健康者出现异常变化。各参数的变化反映着肝损伤程度，掌握各参数变化情况对临床治疗有着重要作用。
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【关键词】 脑出血 白细胞总数 中性粒细胞计数 病情程度 预后
脑出血（ICH）是指非外伤性脑实质出血，为中老年人常见的脑血管疾病。具有起病急、进展迅速、致残率高、病死率高等特征。1994年3月—2006年9月，对本院收治的482例急性脑出血患者进行外周血白细胞总数和中性粒细胞数检测，并分析二者变化与病情轻重及预后的关系，现报告如下。
1 对象和方法
1.1 对象 本组482例，男292例，女190例。年龄56～94岁，平均68.32岁。所有病例均符合中华医学会第4届脑血管病会议诊断标准［1］。经临床检查及CT或MRI证实， 其中壳核出血297例，丘脑出血49例，脑叶出血46例，小脑出血49例，脑干出血41例。按神经功能缺损评分标准［1］（入院后12 h内进行），轻型（0～15）198例，中型（16～30）172例，重型（31～45）112例。排除标准：血液系统疾病；发病时及前2周有严重感染性疾病；伴有恶性肿瘤或自身免疫性疾病；发病前1个月使用过激素或其他免疫抑制剂。
1.2 方法 所有患者均在入院后24 h内查外周血。检测采用美国库尔特－贝克曼公司MMX5分类血细胞计数仪及其原装配套试剂。
1.3 分组 根据外周血白细胞总数及中性粒细胞计数值进行分组。按白细胞总数水平，将患者分为正常组（
1.4 统计学处理 采用SPSS 11.5软件对数据进行统计分析，行χ2检验 ，检验水准：α＝0.05。
2 结 果
2.1 外周血白细胞总数与急性脑出血患者病情及预后的关系 见表1。
白细胞总数升高组与正常组相比，中、重度患者所占百分比显著增高（分别为P＜0.01， P＜0.05），病死率显著增高（P＜0.05）；白细胞总数显著升高组与正常组相比，中、重度患者所占百分比显著增高（分别为P＜0.05， P＜0.01），病死率显著增高（P＜0.01）；白细胞总数显著升高组与升高组相比，中、重度患者所占百分比无显著差异（P＞0.05），病死率显著增高（P＜0.01）。
2.2 中性粒细胞计数与急性脑出血患者病情及预后的关系 见表2。 表1 白细胞总数与急性脑出血患者病情及预后的关系表2 中性粒细胞计数与急性脑出血患者病情及预后的关系与正常组比较:*P
中性粒细胞计数升高组与正常组相比，中、重度患者所占百分比增高有显著性意义（分别为P＜0.01， P＜0.05）， 病死率增高有显著性意义（P＜0.01）； 中性粒细胞计数显著升高组与正常组相比，中度患者所占百分比无显著差异（P＞0.05），重度患者所占百分比升高有显著性意义（P＜0.01），病死率增高有显著性意义（P＜0.01）； 中性粒细胞计数显著升高组与升高组相比，中、重度患者所占百分比无显著性差异（P＞0.05），病死率增高有显著性意义（P＜0.01）。
3 讨 论
一般认为，脑出血的预后受多种因素的影响，如发病年龄、发病前病理基础、出血部位、出血量、合并症等。一些临床研究表明，脑出血发病后血糖、肾功能、白细胞计数等可作为判断脑出血预后的良好参数［2］。本组资料显示，急性脑出血的早期会出现白细胞及中性粒细胞增高，白细胞总数和中性粒细胞计数增高提示病情严重［3］、预后差、病死率高。
分析脑出血后白细胞增高的原因，可能与以下几点因素有关：①脑出血后脑组织水肿明显，导致颅内压增高，下丘脑及垂体轴的神经体液内分泌增强，交感神经兴奋性增高，血浆皮质醇增加引起白细胞反应性增高；②丘脑、下丘脑受压引起严重自主神经功能失调症状，缺氧及交感神经兴奋促进骨髓池的释放，导致白细胞增加；③血液对脑膜刺激，白细胞反应性增高。
脑出血后，白细胞，主要是多型核细胞和单核细胞，可被某些物质所激活成为活化白细胞［4］，后者的流变学行为可发生改变，表现为聚集性、黏附性显著增高和变形能力显著降低。同时，血液中可溶性细胞间黏附分子－1（sICAM-1）［5］、核转录因子（NF-κB）、白细胞介素－6（IL－6）、基质金属蛋白酶（MMPs）显著增高。sICAM-1是最重要的白细胞－内皮细胞黏附分子之一，可介导白细胞黏附，造成微循环堵塞，脑组织有效灌注压下降，并释放神经毒性物质，引起并加重脑组织的继发性的缺血性损害［6］。NF-κB［7］是一种具有多向转录调节作用的蛋白质，参与炎症反应、细胞凋亡等重要的病理生理过程，持续激活可诱导神经细胞死亡。 IL－6是一种促炎症介质，在脑出血后调节成熟的中性粒细胞功能，参与脑损伤。MMPs的作用是攻击脑血管的基底膜和破坏血－脑屏障，导致脑出血和脑水肿［8］。活化中性粒细胞产生大量的氧自由基，引起脂质过氧化反应，丙二醛（malondialdehyde，MDA）产生过多［9］，使脑组织神经、血管内皮细胞生物膜结构破坏，膜通道开放，导致兴奋性氨基酸释放和细胞外钙离子内流［10］。活化的中性粒细胞释放一种细胞毒性的弹性蛋白，它可降解细胞外基膜成分，血-脑屏障遭破坏［11］。活化白细胞可产生多种生物活性物质、酶类（蛋白水解酶等），对局部脑组织（脑神经元和神经胶质）造成直接而严重的损伤。活化白细胞使细胞因子的产生和释放增加，它们可激活补体产生补体介导的细胞损伤。脑组织受损后可进一步诱导白细胞变形能力的降低，形成恶性循环，疾病的严重程度不断加重以致造成疾病的不良预后。
脑出血后，炎症反应是病情加重的重要原因之一。类似于脑梗死，脑出血后血肿周边会存在缺血半暗带［12］。半暗带内神经元的病理改变在一定时间内是可逆的。因此，对于脑出血患者，早期对其病情及预后进行评估，并采取积极有效的抗感染、脱水以及稳定血压、维持水电解质平衡等对症处理，能够改善神经功能［13］、提高治疗效果、降低病死率及并发症。外周血白细胞及中性粒细胞计数方法简单易行，不受条件限制，可作为常规检查、评估项目之一。
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【摘要】 目的对亚洲带绦虫膜联蛋白B2(Annexins B2)进行克隆表达及免疫学初步研究。方法利用在线生物信息学工具从亚洲带绦虫成虫cDNA文库中筛选出Annexins B2基因，并将该基因克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠埃希菌BL21/DE3中诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定，重组后的蛋白用His-镍蛋白纯化柱纯化，纯化的重组蛋白用Western blotting进行免疫学分析。结果PCR、双酶切及重组质粒DNA测序均显示重组体构建成功，并得到高纯度的蛋白，且该重组蛋白可被亚洲带绦虫、猪带绦虫及牛带绦虫患者的血清识别。结论亚洲带绦虫成虫Annexins B2基因可在原核表达系统中获得具有免疫活性的高效表达。
【关键词】 亚洲带绦虫;膜联蛋白B2;基因克隆;免疫反应性
ABSTRACT: ObjectiveTo clone and express the gene named as Annexins B2 of Taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.MethodsBy online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the Taenia saginata asiatica full-length cDNA plasmid library， the gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then transformed to E.coli BL21 with IPTG induction. Thereafter， the gene product was analyzed by SDS-PAGE and purified by Ni-NTA affinity chromatography. In addition， the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by Western blotting.ResultsAs demonstrated by PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. The recombinant protein tested with Western blotting analysis could react with Taenia asiatica and Taeniarhynchus saginatus infected patient serum.ConclusionThe Annexins B2 of Taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; Annexins B2; gene cloning; immunoreactivity
鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cDNA质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白B2(Annexins B2)的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pET-28a(+)及大肠埃希菌BL-21/DE3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。
1.1.2主要试剂和工具酶Ex Taq酶(含dNTP)，BamHⅠ，XhoⅠ，T4 DNA连接酶 (大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(美国Promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1Annexins B2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫Annexins B2基因进行BLASTX分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上BamHⅠ和XhoⅠ的酶切位点进行PCR反应。
1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定PCR产物和pET-28a(+)载体分别用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌BL-21/DE3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和PCR鉴定，并进行重组质粒DNA测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的Ni-IDA His.Bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用PBS 24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。
1.2.4Western blotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗人IgG进行Western blotting鉴定。
2结果
2.1Annexins B2基因的识别和序列分析该基因全长922bp，编码区为224～686bp。其最大ORF为其完整编码区。
2.2原核重组质粒的鉴定将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物行0.8g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带，与目的基因大小基本相符。此外，重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到E.coli BL/DE3中，超声裂解后SDS-PAGE电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2)，与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526g/L。
2.3Western blotting鉴定纯化蛋白的免疫反应性
用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、感染牛带绦虫的患者血清以及亚洲带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白反应的结果均显示出较清晰的条带，而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带(图3)，表明该表达产物具有良好的免疫反应性。图1重组质粒的PCR和双酶切鉴定
Fig.1 The identification of the pET-28a(+)-Ta Annexins B2 by PCR amplification and digestion with restriction enzymesM1：DNA标准(DL2000);1：PCR产物;2：pET-28a(+)质粒双酶切;3：pET-28a(+)-Annexins B2重组质粒双酶切;M2：DNA标准(DL 15000)。图2100g/L SDS-PAGE分析pET-28a(+)-Ta Annexins B2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物Fig.2 100g/L SDS-PAGE analysis of the prokaryotic expression product and purified product
M：蛋白Marker;1：pET-28a(+)IPTG未诱导;2：pET-28a(+)IPTG诱导;3：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG未诱导;4：pET-28a(+)-Annexins B2 IPTG诱导;5：pET-28a(+)-Annexins B2上清;6：pET-28a(+)-Annexins B2沉淀;7：pET-28a(+)-Annexins B2纯化蛋白。
3讨论
带绦虫病的流行在我国西部一直是一个严重的公共卫生问题。每年由带绦虫病造成的健康和畜牧业经济损失上百亿，严重影响西部欠发达地区的社会发展。目前，亚洲带绦虫病的防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机制研究。图3重组蛋白的Western blotting 鉴定Fig.3 Western blotting analysis of the recombinantsM：蛋白Marker;1：纯化蛋白与亚洲带绦虫患者血清的反应结果;2：纯化蛋白与牛带绦虫患者血清的反应结果;3：纯化蛋白与猪带患者血清的反应结果;4：纯化蛋白与亚洲带绦虫感染猪血清的反应结果;5：纯化蛋白与正常人血清的反应结果。
本实验通过生物信息学方法从已经构建好的亚洲带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出了一个膜联蛋白(Annexins B2)的同源基因，并且预测出该基因位于胞浆，无跨膜区，二级结构基本上是以α螺旋为主。这些都符合膜联蛋白家族的共同特征[4]。根据膜联蛋白家族分布广泛，表达丰富且稳定的特性，可以推测其在绦虫的生理活动中可能起着重要的作用。
膜联蛋白是一个广泛存在的蛋白家族，在所有真核基因组中广泛表达。具有内部重复单位和“G-X-G-T-(38residues)-D/E”基序[5]，即Ca2+结合区域的特征，用以结合带有负电的脂质。虽然它为钙结合蛋白，但是在结构上却没有EF手，而且在和Ca2+结合后，还可以与磷脂再次结合而发挥生物学效应。例如，细胞的胞吞胞吐，离子通道的形成，调节磷脂酶A2的活性及细胞内外Ca2+浓度、抗炎症反应等。在长期的生物进化过程中，膜联蛋白家族各成员在生物学特性和生理功能方面表现出非常复杂的关系，且在研究过程中发现，annexins没有信号肽，没有跨膜结构，是一个典型的细胞内蛋白。但是，却有学者发现它可以与细胞外基质发生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制肿瘤[8]等。最新的研究报道，当将其作为疫苗的候选因子时，可以消除一些寄生于哺乳动物体内的寄生虫。此外，学者们认为膜联蛋白是维持细胞膜表面结构和信号转导功能的重要蛋白。并可能具有激活纤维蛋白酶原的功能，有助于破坏宿主的结缔组织，使虫体抗原更加容易进入宿主机体，诱发免疫应答。因此，对该基因的研究有助于进一步了解它的生物学功能及开辟预防治疗寄生虫病的新途径[9-10]。
目前，Annexins B2已经在猪囊尾蚴的研究被发现并命名，但是具体的生理功能还不清楚，且在亚洲带绦虫研究领域还是空白。因此，本研究将亚洲带绦虫成虫annexins克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，构建重组质粒，在大肠埃希菌BL-21/DE3中用IPTG诱导表达，表达产物通过SDS-PAGE电泳进行鉴定。SDS-PAGE结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，上清中有微量的表达，说明annexins主要表达在包涵体中。因此，进一步溶解包涵体[11]，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。此外，还尝试性的用上清过柱纯化并用蔗糖进行蛋白浓缩，也得到部分有活性的蛋白。Western blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的，可用于不同抗原的比较和定量。其检测结果表明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应且在绦虫中的诊断特异性不高，推测其不能作为免疫诊断抗原的合适候选分子。但是，其具有免疫活性的高效表达。由此可推测它是一个具有开发潜力的基因。总之，本项研究填补了该蛋白在亚洲带绦虫研究领域的空白，也为进一步研究该基因的生物学功能及在诊断尤其是疫苗研究方面奠定了基础。
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关键词 密齿花键；容屑槽；齿圈的跳动；深孔
中图分类号TH13 文献标识码A 文章编号 1674-6708（2013）94-0182-02
1 细长主动轴的主要功能
细长主动轴是涡轮发动机滑油泵重的一个重要零件，其传动功率1.3kW，使泵输出流量（增压级）9.3L/min～11L/min。滑油泵用6个螺钉水平安装在机匣体上，为6级齿轮泵，一级增压，5级回油。增压级齿轮和回油级齿轮都共用一根主动轴和一根从动轴。泵组的主动轴通过花键轴与机匣体中输出轴相连，各级齿轮靠半圆健传扭。
2 细长主动轴的结构特点
细长主动轴材料为38CrMoAlA优质合金结构钢，强度、韧性好，是轴类零件优选的材料。其零件也是典型的空心细长轴：长358mm，直径φ12h6，轴外径公差仅0.011mm；长径比40.6；壁厚薄仅1.4mm；内花键是小模数花键（m=0.75），齿圈对基准φ12h6的跳动≤φ0.04，跨距尺寸6.095 +0。066 0mm。
3工艺分析及工艺路线的确定
从零件的结构特点可以看出，零件设计基准为φ12h6的外圆，其表面粗糙度Ra0.4，轴两端有30°倒角，因此外径通过两端的顶尖孔定位磨削加工出来。这样可将设计基准转换到两端的顶尖孔上，使两端的顶尖孔成为工艺基准。内孔的加工根据内孔尺寸φ9.2+0.08 +0.03，深300mm，表面粗糙度Ra3.2的要求，可选择采用钻、扩、孔铰的方式进行加工。使内孔相对基准外圆φ12h6的同轴度φ0.05得到保证，同时在粗加工中保证了壁厚的均匀。内花键加工由是细长主动轴中的最重要的部位，对于一般的内花键可选择采用插削或拉削进行加工，但其部位模数小，齿数又少，花键轴向长度长，尺寸精度高。如采用插削加工，则插刀刀杆较细，加工时刚性差，齿形面粗糙度Ra1.6和齿形精度难以达到设计要求。如内花键采用拉削方法加工，由于拉削的速度低，切削厚度小，加工相对平稳，固可获得很高的表面加工质量，能够满足细长主动轴内花键的各项精度要求。
按设计要求，细长主动轴要经调质和氮化两次热处理，为保证细长主动轴获得必要的机械性能，需要在氮化前进行调质处理，使心部获得索氏体组织，由于零件是从棒料开始进行加工，粗加工后，对其进行调质，也可以改善后工序的机械加工性能。氮化后提高零件的表面硬度、耐磨性和疲劳强度。氮化温度虽不很高，但对于细长主动轴来说，要保证其外圆和内花键在氮化后精度不变是很困难的，因此氮化前需留精加工余量以便进行修整。
通过已上的分析，试制拟定的主要工艺路线是：棒料--粗车--调质--数车--磨基准—--拉花键--稳定处理--半精车--钻孔--氮化--修复基准--精车--精磨--磁检--检验。
4 加工工艺难点
细长主动轴的内花键采用拉削加工虽具有精度高、表面粗糙度好、适应批量生产的优点，但由于主动轴内花键的模数小，定位支靠面短等在拉削过程仍遇到了如下的加工难点：
1）内花键内孔两端尺寸大小不等；
2）跨距尺寸6.095 EQ-0. 分布不均，有的方向跨距小，通端量规放入是很紧；有的方向跨距大，止端量规也能轻松放入，且测量不准；
3）齿圈跳动达不到设计要求，图纸要求齿圈跳动≤φ0.04，实际跳动达0.08；
4）内花键齿面有条状划痕，表面粗糙度达不到设计要求的Ra1.6；
5）内花键齿面小，齿圈跳动和跨距尺寸测量不准确；
6）内孔φ9.2+0.08 +0.03深300mm，内孔加工属典型的深孔加工，排屑不畅常造成内壁拉伤，孔壁上留有螺旋状拉沟深0.1mm～0.15mm，影响内孔表面的加工质量。
5 原因分析及解决措施
1）由于零件的各部位的孔壁厚薄不均匀，且孔壁又薄，拉削长度较大，从而造成内花建内孔尺寸大小不等，在加工应力的作用下，孔口两端变形。解决措施是通过修磨拉刀刃口保证其锋利，在改进的拉刀上增加了精切齿和校准齿各一个，使得齿升量由0.06mm减少到0.025mm，达到了降低拉削力和零件变形量的效果；
2）花键孔拉削是以基准外圆φ12 h6为定位基准，以φ15h6台阶端面为支靠。φ12 h6外圆被φ15h6凸台隔为两段，内花键一端φ12 h6外圆长度为23mm，而另一端φ12 h6外圆长228mm。原工艺是以内花键一端的外圆为定位基准，由于定位面短，零件悬空在夹具外的部分长，加工时拉刀刀齿断续切削产生的震动使零件也产生明显的摆动，加工出来的花键跨齿距尺寸不均匀。采用改变加工基准的措施，将较短的一端外圆定位改为较长的一端外圆定位，并提高较长的一端外圆尺寸精度，减少与拉削定位套的配合间隙，使定位面加长，加工时不易产生零件摆动，跨距尺寸精度获得了明显的提高；
3）由于原工艺的预制孔加工精度不高，铰孔尺寸为φ7.54 +0.1 0，公差0.1较大，且预制孔φ7.54 +0.1 0对基准外圆φ12h6跳动要求为自由公差0.1，同时原工艺路线稳定处理是放在内花键加工后进行的，零件变形直接影响到内花键齿圈跳动，此时花键加工已到尺寸，齿圈跳动较大也无法修正，给精度保证带来了困难。因此除不能为拉刀提供准确的引导外，还将基准的误差、稳定处理变形误差带入。采取的措施是提高内花键预制孔的加工精度，将原工艺规定的钻孔φ7.54 +0.1 0改为磨孔至φ7.54 +0.015 0，而且在磨基准外径φ12h6工序之后进行磨预制孔，并对基准外径提出同轴度≤φ0.01的要求。拉刀引导部分尺寸为φ7.54 -0.005 -0.014，拉刀引导部分与零件预制孔间隙由0.005～0.114减少到0.005～0.029，这样引导部分就能起到准确的引导作用，保证花键齿圈的跳动要求。同时将稳定处理工序提前到拉花键之前，内孔半精加工之后进行，使半精加工产生的应力得到释放，在拉削过程中，余量不多且是逐步去除，变形就小很多。
4）齿面有条状划痕产生的原因a未及时清除拉刀刀齿上的细小的切屑而继续进行拉削，使刀齿前角、容屑槽形发生变化。b 拉刀制造未达设计的容屑槽形，容屑槽形不合理，根部的圆角R偏小且有微台阶，使得切屑不易卷曲，排屑不畅，在已加工表面产生条状划痕。采取用刷子仔细将刀齿上细小的切屑清除或用高压切削液冲洗，刃磨时保持容屑槽底部圆角R的形状，成型砂轮修圆滑去除槽底微台阶；
5）内花键齿圈测量跳动时，一般采用V型铁检查，即以零件φ12h6的基准外径放在V型铁上，再将滚棒放在内花键型面处，转动零件，用百分表量出各齿上滚棒的跳动值。虽然这种方法符合一般测量原理，但操作困难。因为内花键太小，又要放滚棒，不方便打表测量。同时在基准外径φ12h6的全长上，靠近内花键处的跳动值要小些，仅为0.02mm～0.03mm，而远离花键一端的跳动值却可达0.1mm～0.25mm.通过分析，假设在内花键全长（11）范围内跳动值是合格的为0.04mm，那么经延长放大后，离花键最远端跳动值可达0.3以上，远远超出所规定的数值了，零件越长则跳动值越大，显然用这种方式检查出来的跳动值很少有合格。解决措施是采用锥度分组花键心棒（分3组）进行检查，即取锥度花键心棒装于零件内花键中，再用顶尖顶住花键心棒，只需用百分表测量花键部位外圆的跳动值即可反映齿圈跳动的真实值，又大大方便了检测。花键加工后，用花键塞规对内花键作用齿槽宽最小值Evmin进行检测，从而控制作用侧隙的最小值Cvmin；用跨距量规对内花键实际齿槽宽最大值Emax进行检测，从而控制内花键的最小实体尺寸。内花键的跨距尺寸为6.095 +0。066 0，原跨距量规采用滚棒和量块分别设计、制造。由于使用时量块和滚棒均较小，且必须用滚棒的圆柱面贴紧量块的平面后才能测量，滚棒与量块间是线接触，极易产生偏移，导致测量误差。为了便于测量跨距尺寸，对原跨距量规进行改进。采取整体式量规设计，即将滚棒与量块两样合在同一量具上，并且为了避免滚棒受力后在量块上转动，在滚棒的头部固定一小方块，确定好角向位置，这样小方块与量块间为面接触了，不必担心滚棒会在受力后而产生转动，保证了测量的可靠性；
6）内孔螺旋状拉沟产生的原因主要是钻孔过程中形成的，由于孔深，直径小，使用的钻头细长刚性差，钻削过程中去除材料多，刀头易产生振动，冷却性能差，铁屑排出不畅刮伤孔壁使得加工出的内控表面有拉沟现象，虽经铰孔也难以消除。经过现场调查，发现在用φ8长钻头加工底孔时刀具材料和刀具的转速的选择明显影响孔壁质量的好坏。现场刀具使用的材料是W9Mo3Cr4V，钻孔时若刀具转速超过300转/分，内孔瞬时温度高，散热效果差，孔壁易烧伤，同时刀具振动加大孔易干斜；若刀具转速低于200转/分，钻头易磨损不锋利，此时加工的铁屑为断屑，同时铁屑附着在钻头切削刃上，产生积屑瘤，对孔壁造成的拉伤最为严重。为此通过改进钻头的材料，使用硬质合金YG8，细化操作流程，钻孔前先打顶尖孔，改用φ8.3的钻头，要求钻头转速控制在240～260转/分，每进20mm退刀冲洗冷却，直至钻通；再使用φ9的扩孔钻扩孔，转速控制在260转/分，由于加工余量不大，每进深40mm左右退刀冲洗冷却，消除钻孔留下的轻微拉沟；最后留0.05mm～0.1mm的精加工余量，进行铰孔。铰孔时选用YD15的硬质合金铰刀，转速控制在小于40转/分，每次铰深10mm后退刀冲洗铰刀及内孔。防止了内孔的拉伤。
6 调整后的工艺路线
通过试制改进，对主要工艺路线进行了调整是：棒料-粗车-调质-数车、打顶尖孔-磨基准外圆-车内孔修顶尖基准-精车-稳定处理-磨基准外圆-车基准内孔-磨基准内圆-拉花键-磨基准外圆-钻孔-检验-氮化-修复顶尖基准-精磨-磁检-检验。
7 结论
通过对原工艺路线的研究分析，改进拉刀切齿数量及容屑槽形，改变加工基准减少与拉削定位套的配合间隙，调整稳定处理的顺序，采取整体式跨距量规增大滚针与量块间为面接触，很好地解决了试制中遇到的各项加工难点，确保了零件的精度要求。
参考文献
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慢性乙肝已成为全球医疗界的难题，我国是慢性乙肝的高发区。据统计，携带HBV病毒者大约有1/4的感染者发展为慢性肝炎；约有4.4%和15%的慢性肝炎患者最终发展为肝细胞癌和肝硬化。目前认为，HBV 感染后疾病的不同表现、转归及临床过程与机体的免疫状态有关，T细胞在清除和抑制病毒感染中发挥重要的作用[1]。而慢性乙肝患者的T细胞功能的缺陷与Treg细胞（调节性T细胞）升高有关。辅T细胞（T helper lymphocytes，Th）在免疫应答过程中发挥重要作用。Th17是近年来发现的不同于Th1和Th2细胞的亚群，与自身免疫反应具有密切的相关性[2]。正常情况下，Treg/Th17保持平衡有利于维持机体免疫状态的稳定。当两者比例失衡后，可导致一系列的免疫炎症反应。本文主要是探讨慢性乙肝患者外周血Treg/Th17细胞水平状态以及与疾病的发病是否存在相关性。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择2012年1～6月在我院进行治疗的慢性乙肝患者30例作为研究组，其中男18例，女12例，年龄23～57岁，平均（31.7±11.4）岁。其中轻度5例，中度16例，重度9例。小三阳16例，大三阳14例。入选标准：①诊断明确；②入组前3个月没有使用影响免疫的药物；③入组3个月没有进行保肝和抗病毒治疗。排除标准：① 其他类型的病毒性肝炎或酒精性肝炎、药物性肝炎；②自身免疫性疾病；③原发性肝癌 ；④代谢性肝病。对照组为在我院进行健康体检的志愿者，共30名。其中男15名，女15名，年龄20～55岁，平均（32.5±12.1）岁。两组的性别、平均年龄比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 检测方法
1.2.1采血方法 清晨抽取肘静脉血8 mL，分置于2支采血管中。1支3 mL肝素抗凝，离心后分离外周血单个核细胞，进行Treg细胞和Th17细胞频数检测。另1支采血管静置后分离血浆进行细胞因子及血生化检测。
1.2.2 Th17细胞频数检测 采用美国BD公司FACS Calibur双激光四色分选流式细胞仪进行检测。采用RPMI-1640 细胞培养基（上海江莱生物科技有限公司）将收集到的外周血单个核细胞调配到细胞密度为2×106/mL，取2mL加入到6孔板内，再分别加入佛波酯（北京中西远大科技有限公司）、离子霉素（上海叶舟生物科技有限公司）、莫能菌素（山东胜利生物工程有限公司），37℃培养5h。收集细胞于测定管和对照管中，每个管中100 μL。每个管中分别加入20 μL的CD8-PE和10 μL的CD3-PC5单克隆抗体，室温下避光孵育15 min。然后室温下固定液100μL进行固定反应15 min，加入PBS（上海抚生实业有限公司）缓冲液3mL，混匀后，离心，弃上清。破膜剂100μL进行细胞打孔，IL-17-FITC 20 μL加入测定管中，对照管中加入20 μL同型对照。室温下孵育20 min后，加入PBS缓冲液3 mL，混匀后静置10 min，弃上清，加入PBS 0.5mL重新悬浮，进行检测。
1.2.3 Treg细胞频数检测 静脉血100 μL，加入20 μL CD4-FITC和20 μL CD127-PE单克隆抗体，10 μL CD25-PC5单克隆抗体，避光下孵育20 min，加入红细胞裂解液2 mL，避光下孵育20 min，加PBS缓冲液3mL洗涤，后加入PBS缓冲液0.5 mL重新悬浮，进行检测。
1.2.4 细胞因子的检测 采用ELISA法进行检测，主要检测血浆中IL-17、IL-10、IL-23及TGF-β1，所有操作均严格按照说明书进行。所使用的试剂由上海韵涵生物科技有限公司提供。
1.2.5 血生化检测 采用BECKMAN COULTER Au5400全自动生化仪进行检测，主要检测总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）。所有操作按说明书进行。
1.3 统计学方法
采用SPSS12.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用卡方检验，计量资料用均数±标准差表示，多组间的比较采用方差分析，两组间比较采用t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 入组时两组血生化结果
由表1可见，在入组时，重度肝炎患者的TBIL和DBIL水平及ALT、AST水平显著高于对照组和轻中度组，而轻中度组的ALT和AST水平显著高于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.01）。
2.2 两组外周血Treg细胞频数和Th17细胞频数比较
由表2可见，研究组外周血Treg细胞频数和Th17细胞频数显著高于对照组，而Treg/Th17显著低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05或
2.3 两组细胞因子水平比较
由表3可见，研究组IL-10、TGF-β1及IL-23水平显著高于对照组，差异有显著统计学意义（P < 0.01或
2.4 Treg、Th17细胞频数和Treg/Th17与慢性乙肝患者临床指标的相关性
Treg、Th17细胞频数在不同性别、不同年龄、HBeAg是否阳性及不同分期组中差异没有统计学意义，而Treg/Th17重度组显著高于轻中度组（P < 0.01）。见表4。
3 讨论
慢性乙肝是一个世界性的疾病，全世界大约有2.8亿的病毒携带者，我国约占1.3亿，因此，我国是慢性乙肝病毒的高发区，大约有3000万病毒携带者发展为乙型肝炎。当乙肝病毒感染机体后，进入肝细胞，形成共价闭合环DNA，成为病毒转录的模板，在早期即可与肝细胞DNA整合[3]。机体自身的免疫状态与慢性乙肝的临床症状、体征、转归等有密切关系。有研究显示，慢性乙肝患者外周血细胞毒性T细胞活性受损，产生抗病毒细胞因子水平下降。其具体机制尚未完全明了，可能是表面抗原和e抗原的大量表达使T细胞发生免疫耐受，慢性乙肝患者对细胞毒性T细胞的负性调控分子高表达促使其功能下降或抗病毒能力下降。Treg细胞升高，抑制了细胞毒性T细胞的增殖。
调节性T细胞对机体的免疫反应具有抑制作用，在调节机体的免疫平衡方面发挥重要的作用。天然的Treg细胞主要通过细胞膜表面的分子与细胞直接接触的方式发挥作用，而诱导产生的Treg细胞主要通过细胞因子IL-10和TGF-β发挥作用。Treg细胞在调节细胞免疫方面具有重要的作用，Treg增多或者减少均会影响到机体的免疫平衡，导致一系列的免疫疾病。研究显示[4]，出生后切除胸腺的小鼠因为缺乏Treg细胞，可出现多种自身免疫性疾病。有研究显示[5]，Treg细胞减少可以增加动脉粥样硬化的发生率，加重局部损伤炎症的反应。本文的研究结果显示，慢性乙肝患者外周血Treg细胞的细胞频率显著高于对照组，说明其参与了慢性乙肝的发病过程，在肝炎的发展过程中。IL-10、TGF-β1是Treg细胞分泌的细胞因子。本研究显示其在慢性肝炎患者外周血中的表达显著升高。
Th17细胞也来源于原始的Th细胞，其与Treg细胞的作用相反，正常情况下两者保持平衡，维持机体的免疫稳定。Th17细胞与多种自身免疫性疾病有关。杜永光[6]研究结果显示，在类风湿关节炎患者外周血中Th17相关的细胞因子IL-17、IL-6和IL-23水平显著升高。李娜[5]等研究显示，慢性心力衰竭患者外周血中Th17细胞水平显著升高，考虑其参与了心力衰竭的发生发展过程。本研究结果显示，慢性乙肝患者外周血中Th17细胞频率显著高于正常对照组，说明Th17细胞参与了慢性乙肝的疾病过程。Th17主要分泌IL-17细胞因子，是一种前致炎细胞因子，参与炎症的发生[7，8]。在本文中，研究组和对照组的IL-17细胞因子水平差异并不明显，提示在慢性乙肝的发生发展过程中，IL-17可能不是主要的细胞因子。IL-23是Th17细胞分泌的另外一种细胞因子，是一种造血细胞因子，可刺激Th17细胞的扩增和维持，可以诱导初始T细胞分化成为Th17细胞[9，10]。本文研究显示，慢性肝炎患者IL-23水平显著升高。
Treg细胞和Th17细胞均由初始T细胞分化而来。IL-2可以抑制Th17的过度表达，同时能够促进Treg细胞的分化，而TGF-β能够诱导两种细胞的分化，IL-6可以诱导初始细胞分化为Th17。总之，两种细胞在分化过程中呈现相互抑制的作用，而两者作用也呈现相互抑制。正常情况下，Treg/Th17保持平衡，以维持机体的免疫稳定。本文的研究结果显示，研究组Treg/Th17显著低于对照组，说明慢性乙肝患者虽然Treg和Th17明显升高，但是Th17升高的幅度更为明显。提示Treg细胞功能及增殖能力相对不足，而Th17细胞增殖旺盛的情况下，导致慢性肝炎的炎症反应。但是比较重度肝炎和轻中度肝炎Treg/Th17结果发现，重度患者显著高于轻中度患者，可能的原因是重度肝炎患者TGF-β1显著升高，而高水平的TGF-β1可以诱导Treg细胞的生成，而低剂量的TGF-β1有利于Th17细胞的生成。增高的Treg有可能抑制Th17细胞的分化，从而发挥抑制免疫反应的作用。
综上所述，慢性乙肝患者外周血Treg细胞和Th17细胞均明显升高，而两者的失衡在疾病的发生发展过程中发挥了重要的作用。本研究还存在一些局限性，比如样本较少、研究时间较短等，对于结果的进一步验证还需要进行大样本研究。
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【关键词】 生长激素-胰岛素样生长因子轴； 血小板参数； 网织红细胞参数； 肝硬化
Study on Detection Significance of GH-IGF Axis，Platelet and Reticulocyte Parameters of Patients with Cirrhosis/HUANG Han-wen，ZHAO Ting-ting，LIN Yun-hui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（10）：043-046
【Abstract】 Objective：To study detection significance of growth hormone-insulin-like growth factor（GH-IGF）axis，platelet and reticulocyte parameters of patients with cirrhosis.Method：From February 2015 to June 2016，49 patients with cirrhosis diagnosed in our hospital were selected as the observation group，49 healthy people of physical examination during the same period were selected as the control group.Then the serum GH-IGF axis indexes，platelet and reticulocyte parameters of the two groups were detected and compared，and the serum GH-IGF axis indexes，platelet and reticulocyte parameters of patients with cirrhosis with different etiology and clinical stages were compared.Result：Serum IGF-1，IGFBP-3，PLT and PCT of the observation group were all lower than those of the control group（P
【Key words】 GH-IGF axis； Platelet parameters； Reticulocyte parameters； Cirrhosis
First-author’s address：The Third People’s Hospital of Longgang District Shenzhen，Shenzhen 518115，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.10.012
肝硬化是R床高发病，关于肝硬化的各类研究十分多见，其中关于肝脏功能包括代谢方面的研究尤其多，而生长激素-胰岛素样生长因子轴作为肝脏代谢过程中的重要指标，对其研究虽可见，但结果差异较大的情况十分普遍，因此对其研究仍十分必要[1-2]。而血小板参数及网织红细胞参数作为在肝脏疾病患者中研究并不少见的指标，对其在肝硬化中的研究也十分必要。本文就生长激素-胰岛素样生长因子轴、血小板及网织红细胞参数在肝硬化患者中的检测意义进行研究，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 将2015年2月-2016年6月期间本院就诊的49例肝硬化患者选为观察组，并以同时间段内49例体检示健康者为对照组。对照组男29例，女20例；年龄32～70岁，平均（50.46±5.57）岁。观察组男28例，女21例；年龄31～70岁，平均（50.51±5.47）岁；病因分类：肝炎后肝硬化患者26例，酒精性肝硬化患者12例，其他肝硬化患者11例；临床分期：代偿期28例，失代偿期21例。两组研究对象的平均年龄和男女比例比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 方法 采集两组研究对象的空腹静脉血进行检测，检测方面包括三大类，即血清生长激素-胰岛素样生长因子轴指标、血小板及网织红细胞参数，其中部分血标本进行离心，取血清部分进行生长激素-胰岛素样生长因子轴指标的检测，采用酶联免疫法对上述检测项目包括生长激素（GH）、胰岛素生长因子-1（IGF-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）及胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）进行检测，另将静脉血标本以血细胞分析仪进行血小板参数[血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板平均体积（MPV）及血小板分布宽度（PDW）]及网织红细胞参数[未成熟网织红细胞指数（IRF）、网织红细胞计数（RET）、网织红细胞生成指数（RPI）及强光散射网织红细胞（HLR）]的检测。然后统计比较两组研究对象的血清生长激素-胰岛素样生长因子轴指标、血小板及网织红细胞参数，并比较不同病因和临床分期肝硬化患者的检测结果。
1.3 统计学处理 采用SPSS 17.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验和方差分析；计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验，P
2 结果
2.1 两组患者不同病因和临床分期的血清生长激素-胰岛素样生长因子轴指标比较 观察组的血清IGF-1及IGFBP-3均低于对照组（P
2.2 两组患者不同病因和临床分期的血小板参数比较 观察组的PLT及PCT均低于对照组（P
2.3 两组患者不同病因和临床分期的网织红细胞参数比较 观察组的IRF、RET、RPI及HLR均高于对照组（P
3 讨论
肝硬化在临床十分常见，在我国肝硬化主要为病毒性肝炎导致，与本类患者相关的研究也极为多见，且研究不仅仅涉及到患者的治疗及其相关方面，对于肝硬化患者发生发展过程中的较多相关指标的研究也十分多见[3-4]。有研究认为，肝硬化患者可能存在不同程度的生长激素抵抗情况，同时也有研究认为生长激素-胰岛素样生长因子轴是与肝代谢及肝细胞增生等有密切关系的指标[5-6]。而生长激素（GH）、胰岛素生长因子-1（IGF-1）、胰岛素样生长因子结合蛋白-1（IGFBP-1）及胰岛素样生长因子结合蛋白-3（IGFBP-3）作为其中的代表性指标，其在肝硬化患者中的变化研究尤为必要，其中的IGFBP-1及IGFBP-3是肝脏内合成的重要指标，其表达水平的波动可有效反应肝细胞功能的变化，故进一步提示我们对其在肝硬化患者中的检测必要性[7-8]。另外，血小板相关指标是在肝硬化患者中研究较多的一凝血相关指标，血小板参数中的血小板计数（PLT）、血小板压积（PCT）、血小板平均体积（MPV）及血小板分布宽度（PDW）作为其中代表性的指标，其在肝硬化中的细致研究仍十分缺乏，因此对其细致变化的探究价值仍较高，而有研究认为主要与肝硬化患者的肝脾功能异常导致的血小板破坏异常等情况有关[9-13]。再者，网织红细胞参数是有效反应机体造血功能状态的指标，而当肝脏处于相对较差的状态时，其造血因子受到影响，因此造血状态即处于异常的状态，但是对其在肝硬化患者的细致监测意义研究十分不足，因此此方面的研究也十分必要[14-15]。
本文中笔者就生长激素-胰岛素样生长因子轴、血小板及网织红细胞参数在肝硬化患者中的检测意义进行分析与研究，主要为将肝硬化患者与体检示健康的人员进行比较，比较结果显示，肝硬化患者的血清IGF-1、IGFBP-3、PLT及PCT均低于健康人员，其他血清生长激素-胰岛素样生长因子轴指标、血小板及网织红细胞参数均高于健康人员，不同病因和临床分期肝硬化患者检测结果也存在明显差异，其中肝炎后肝硬化患者的表达水平相对更差，与此类患者肝炎期肝脏状态即受到不同程度的不良影响有关，同时，失代偿期的异常程度明显大于代偿期，说明上述指标的检测不仅仅对于肝硬化的诊断有一定的临床意义，且对于肝硬化的病因分类和临床分期也有一定的指导意义[16-20]。
综上所述，笔者认为生长激素-胰岛素样生长因子轴、血小板及网织红细胞参数在肝硬化患者中的检测意义较高，上述指标对于肝硬化的病因和临床分期均有积极的临床检测价值。
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【关键词】 恶性肿瘤；流式细胞仪；淋巴细胞；CD；免疫治疗
【Abstract】 Objective To explore the application of flow cytometry for the changes of multiple immune indexes in peripheral blood of malignant tumor patients and the clinic value of the indexes for the immunotherapy of malignant tumor.Methods Flow cytometry was employed for determining eight indexes，including CD3、4、8，et.of 50 malignant tumor patients and 31 healthy persons.Furthermore，the results before and after immunotherapy of 10 patients were compared.Results Immune function of malignant tumor patients is generally disordered.1.Both the cell immunity and the body fluid immunity are low.2.The level of active T lymphocytes are greatly high with the control(P
【Key words】 flow cytometry； malignant tumor； lymphocyte； cluster of differentiation(CD)； immunotherapy
恶性肿瘤的发生、发展与机体免疫系统密切相关。运用流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原(CD3、CD4、CD8)，B淋巴细胞表面抗原(CD19、CD20)，NK细胞表面抗原(CD16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、B、NK淋巴细胞的免疫指标(CD3/HLA-DR、CD3/CD25)的变化，探讨淋巴细胞在肿瘤中的表达状况及其意义，并进一步分析恶性肿瘤病人免疫治疗前后的免疫功能改变，以致使我们更深一层认识肿瘤在细胞水平的免疫功能。
1 资料与方法
1.1 研究对象 2003年8月～2004年5月本院肿瘤科病房50例恶性肿瘤病人，均经病理确诊，其中肺癌23例，肝癌6例，乳癌4例，胃癌5例，胰腺癌2例，淋巴瘤4例，结肠癌3例，鼻咽癌1例，肾癌2例。男28例，女22例，年龄29～65岁，平均57岁。其中10例(肺癌6例，淋巴瘤4例)年龄29～53岁，平均41 岁，经免疫增强剂(高聚生4ml静滴，每日1次，共3个月；白介素Ⅱ30万U皮下注射，每周2次，共3个月)治疗一疗程(3个月)后，复查一次。
对照组31例为健康体检者，男18例，女13例，年龄36～50岁，平均43岁，其中年龄和性别构成比与病人组差异无显著性(P＞0.05)。
1.2 材料与仪器 小鼠抗人单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD19、CD20、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25及同型对照、红细胞裂解液(Optilyse C)均为法国Immunotech公司出品。流式细胞仪(Epics XL·MCL)是美国BECKMAN COULTER公司生产。
1.3 研究方法 使用直接免疫荧光标记全血溶血法，流式细胞仪测定肿瘤病人外周血淋巴细胞表面抗原表达。
1.3.1 淋巴细胞表面标记 取荧光标记单克隆抗体CD4/CD8/CD3、CD3/CD16+56、CD3/HLA-DR、CD3/CD25、CD19、CD20各10μl放入试管中，分别加入外周全血100μl，室温避光孵育15min。并作同型对照。
1.3.2 溶血 加入Optilyse C 500μl，混匀，室温避光10min。
1.3.3 洗涤 离心(1500r/min)5min，弃去上清液，加入PBS液1ml，混匀。重复洗涤1次。
1.3.4 重悬 加入1ml PBS，混匀，制成单细胞悬液。
1.3.5 检测 上机，每个样品检测5000个以上细胞，用FCM软件分析，计算淋巴细胞中各标记细胞的百分率。最后所有数据应用SPSS进行统计学处理。
2 结果
对50例恶性肿瘤病人与31例健康体检者进行外周血淋巴细胞表面抗原FCM检测，做统计学分析，结果见表1。
对10例肿瘤病人在免疫治疗前后淋巴细胞表面抗原和活化T淋巴细胞抗原的表达进行了FCM测定，发现CD4+、CD3+、CD4/CD8比值、CD3+/CD16+56+、CD3+/HLA-DR+、CD3-/HLA-DR+治疗前均较治疗后有显著性升高((P
注：与对照组相比，* P
注：与治疗后相比，*P
3 讨论
肿瘤不是一个简单的疾病过程，肿瘤免疫更是一个复杂的过程。恶性肿瘤病人往往免疫功能状态紊乱和低下，而免疫状态在一定程度上可预示着肿瘤的发展和预后［1］。由于肿瘤免疫过程复杂特异蛋白少，或是肿瘤细胞或蛋白样物质掩盖了肿瘤抗原，使目前检查手段和蛋白分离方法尚不能检出肿瘤抗原。而通过实验性动物和对人类恶性肿瘤病人大量研究表明：免疫系统的所有有效应成分均对消除肿瘤细胞、控制肿瘤生长有作用，发挥免疫功能的淋巴细胞约占白细胞总量的20%，可分为T、B细胞、NK细胞、巨噬细胞和树突状细胞。通常采用单克隆抗体来分析细胞表面抗原分子，并对其分化群(簇，clusters of differentiation)进行了定义，用CD来描述白细胞表面抗原的不同成分。这样通过对恶性肿瘤病人相应免疫指标(CD分子)的检测，可对恶性肿瘤病人的预后进行判断并指导治疗和观察转归［5～7］。
3.1 T淋巴细胞及表面抗原(CD4、CD8、CD3)与肿瘤的关系 大量研究工作已证实，宿主对机体内发生的肿瘤组织有自发性抵抗现象，而且以细胞免疫为主［8］。众所周知，机体的细胞免疫由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞的主要功能是调节蛋白质抗原引起的所有免疫应答，并清除细胞表面抗原或细胞内微生物的效应作用。T淋巴细胞进一步分化为辅T淋巴细胞(Th，CD4+/CD3+)和细胞毒性T淋巴细胞(Ts，CD8+/CD3+)，对于抗原刺激的应答，辅T淋巴细胞分泌细胞因子。细胞因子可促进T淋巴细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞的增殖和分化。McMichael认为［9］T淋巴细胞作为细胞免疫调节的中心枢纽，Th和Ts细胞之间的平衡是通过CD4+和CD8+细胞之间的百分比表达出来的，其值下降表示免疫状态受抑制。目前研究还发现，CD4+细胞在协同杀伤肿瘤细胞中起着重要作用［18］，CD4+细胞数减少可使肿瘤细胞发生免疫逃逸［10，11］。亦有学者认为机体发生肿瘤时，在肿瘤局部的微环境发生免疫功能紊乱，表现为局部的CD8+亚群增高或降低，或识别肿瘤抗原上发生障碍，但恶性肿瘤病人的免疫功能直到很晚才发生［12］。对于大多数肿瘤细胞来说，肿瘤细胞表达CD8+而不是CD4+，CD4+不能辨认肿瘤细胞，而是依赖于抗原提呈细胞，如果相关的肿瘤抗原被巨噬细胞提呈(DC)，则对CD4特异性激活后才分泌淋巴因子激活CTL细胞、巨噬细胞和B细胞，产生其他淋巴因子和淋巴毒素和肿瘤坏死因子，肿瘤坏死因子可溶解肿瘤细胞。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人进行外周血FCM检测，肿瘤组CD3、CD4+/CD3+、CD4/CD8比值明显低于对照组，肿瘤组CD8+/CD3+明显高于对照组，这表明恶性肿瘤病人的细胞免疫明显低下(P
3.2 B淋巴细胞及表面抗原(CD19、CD20)与肿瘤的关系 肿瘤的体液免疫是B细胞及抗体依赖的杀伤作用。B细胞表面免疫球蛋白与肿瘤抗原结合，处理和递呈肿瘤抗原，从而诱导T细胞对肿瘤的应答。B细胞所产生的抗体是多克隆异源性抗体。CD20是一非免疫球蛋白产物，参与细胞激活，是B细胞的特异性标志，前B细胞至活化B细胞时表达这一分子。而CD19作为全B细胞表面标志性抗原，是B细胞活化的共受体［13］，在B细胞活化后消失，在外周血中正常分布为8％～15％。通过对CD19与CD20的检测，可在一定程度上反映出机体体液免疫功能状态［14］。本文对50例肿瘤病人的CD19、CD20进行检测，其中恶性肿瘤病人组CD19与CD20明显低于健康对照组(P
3.3 NK细胞及表面抗原(CD16、CD56)与肿瘤的关系 NK细胞是正常机体中对肿瘤细胞具有高度细胞毒性作用的淋巴样细胞，是一种广谱的杀伤细胞，对阻止肿瘤生长起重要作用。NK细胞是不同于T 、B淋巴细胞的淋巴细胞群，它们在体内相对较少，它们来源于骨髓的大颗粒细胞。它们不需预先致敏即能分泌细胞毒因子，从而杀伤肿瘤细胞［16］ 。虽然NK细胞无靶细胞特异性，但在缺乏抗体和ADCC效应时，它们表现几种水平的靶细胞选择性：首先，它们对肿瘤细胞比对大部分正常细胞更具毒性作用；其次，不同的NK细胞克隆对不同来源的肿瘤类群表现不同的细胞毒模式。NK细胞代表了宿主抵抗原发和转移部位肿瘤生长的第一道防线，并通过T细胞补充特异性抗肿瘤应答。在某种意义上说，NK能强烈杀伤肿瘤细胞。有研究表明，体外介导杀伤大多肿瘤细胞的细胞亚群，90％以上是激活的NK细胞［17，18］。NK细胞表面标志主要是CD16和CD56，其中CD16一般表达于未成熟NK细胞表面，CD56于成熟NK细胞表面，二者有交叉。其表达水平与NK细胞的整体活性具有相当的作用，其下降提示机体NK细胞作用受抑制，细胞免疫功能下降，不能有效发挥杀伤肿瘤细胞作用［2］。陆云等认为［19］CD16或CD56细胞数与NK细胞活性相关性随不同疾病及疾病不同阶段而变化。张峻梅等［20］认为，肺癌病人NK细胞数与正常对照无显著性差异。本文对50例肿瘤病人和31例健康人的NK细胞即CD3+/CD16+56+进行比较，恶性肿瘤病人NK细胞较对照组显著升高(P
3.4 活化淋巴细胞及表面抗原(CD25、HLA-DR)与肿瘤的关系 静止T淋巴细胞在接受刺激后可发生增殖活化而形成效应细胞，表现为细胞因子的分泌及细胞因子受体和粘附分子在细胞表面表达。T淋巴细胞活化需T细胞受体与相应抗原结合为第一信号，同时又必须辅以第二信号即共刺激分子的结合，而T淋巴细胞的分裂增殖是以细胞因子与IL-ɑ受体(IL-2R)的结合为启动信号的，故可以通过检测T淋巴细胞的CD3+/HLA-DR+、CD3+/CD25+等活化抗原来监测T淋巴细胞活化状态。本文通过对50例恶性肿瘤病人和31例健康人CD3/HLA-DR和CD3/CD25进行测定，发现恶性肿瘤病人CD3+/HLA-DR+显著降低(P
3.5 免疫治疗与肿瘤的关系 免疫既影响肿瘤生长，肿瘤的宿主也会发生免疫的改变，如果能使免疫低下的恶性肿瘤病人免疫功能得以调节，必然有利于肿瘤的控制。许多研究表明，患有肿瘤的个体可对肿瘤产生免疫抑制。随着人们对人类肿瘤抗原分子的认识，肿瘤细胞具有抗原性并能引起抗体免疫应答是肿瘤免疫治疗的基础。免疫治疗作为癌症治疗方法的一种，主要通过宿主天然防御机制或天然哺乳动物材料做药物而发挥抗肿瘤效应，生物疗法是继手术、放疗、化疗之后，已成为癌症治疗的第四种重要方法。本文结果提示恶性肿瘤病人的免疫功能存在缺陷，免疫治疗可改善病人T淋巴细胞的数量和比例；同时，亦可直接刺激T淋巴细胞的活化，增强机体细胞和体液免疫功能。
体外试验中，IL-2的使用提高了淋巴细胞对肿瘤的反应性［22］，IL-2用来刺激产生LAK细胞，LAK细胞可依一种非MHC限制方式识别新鲜肿瘤细胞，而不识别正常细胞［23～25］，从而对肿瘤细胞产生免疫应答。本文对10例恶性肿瘤病人进行高聚生、IL-2免疫治疗，并观察治疗前后各分子的变化，其中CD4+/CD3+、CD3+、CD4/CD8比值、NK细胞(CD3+/CD16+56+)、活化T淋巴细胞(CD3+/HLA-DR+)，活化B、NK细胞(CD3-/HLA-DR+)较对照组均显著性增高(P
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