细胞增殖论文优选九篇

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第1篇

【关键词】骨髓内皮细胞GMCSF细胞增殖

EffectsofGranulocyteMacrophageColonyStimulatingFactoronGrowthofMurineBoneMarrowEndothelialCells

AbstractThepurposeofthisstudywastoinvestigatetheeffectsofgranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor(GMCSF)onthegrowthofmousebonemarrowendothelialcells.Endothelialcellculturemedium（EndoM）wasusedtoculturemurinebonemarrowendothelialcells.EndothelialcellcolonieswerecountedundermicroscopebyWrightGiemsastaining.TheeffectofdifferentconcentriationofGMCSFontheproliferationofbonemarrowendothelialcellswasobservedbytheformationofendothelialcellcolonies,MTTandflowcytometry.TheresultsindicatedthattheendothelialspecificmarkervWFwasexpressedbythecolonycells,GMCSFpromotedtheproliferationofbonemarrowendothelialcellcoloniesandMTTconfirmedtheeffectofGMCSFonpromotingtheproliferationofbonemarrowendothelialcells.TheresultofdetectingcellcycleshowedthattherateofcellsenteringintoSphasewas9.3%inGMCSFaddedgroupandtherateofcellsenteringintoSphasewas2.1%incontrol.Therewasnosignificantdifferenceincellgrowthcurvebetweenthefirstpassageandfourthpassage.ItisconcludedthatGMCSFcanpromotetheproliferationofbonemarrowendothelialcells,theproliferationpotentialofbonemarrowendothelialcellsbetweenthefirstandfourthpassagenosignificantlychanges.

Keywordsbonemarrowendothelialcells;GMCSF;proliferation

JExpHematol2007;15(3):622-625

目前，已有许多报道证明内皮细胞（endothelialcells,EC）、内皮祖细胞（endothelialprogenitorcells,EPC）可以用来治疗缺血性心脏病以及各种疾病引起的肢体缺血［1,2］也可以用于组织工程的血管构建［3］，并取得了一定的成果。Kawamoto等［4］报道，EPC对缺血心脏病进行治疗具有良好的效果，一方面减少了缺血组织的面积，同时改善了心脏的功能。Kalka等［5］则报道了利用EPC对肢体缺血的小鼠模型进行治疗，实验结果表明了EPC能显著增加缺血肢体的灌流，而且组织学检查发现缺血部位毛细血管的数目也大大增加。内皮细胞的来源有多种，可以从外周血、脐血及骨髓中获得［6］，而外周血中的内皮祖细胞来源于骨髓。从病人自体的骨髓中获得内皮细胞，一方面来源比较方便，而且也可以避免GVHD的发生。但是由于骨髓基质细胞种类多，难以分离纯化骨髓内皮细胞或内皮祖细胞。本研究用本实验室配制的内皮细胞培养液（EndoM）体外培养小鼠骨髓细胞，分离纯化骨髓内皮细胞及内皮祖细胞，并观察粒巨噬系集落刺激因子（rmGMCSF）对小鼠骨髓内皮细胞体外增殖的影响以及体外增殖后内皮细胞增殖机能的改变，这对临床运用内皮细胞或内皮祖细胞治疗疾病有一定的指导意义。

动物

昆明小鼠，由中南大学湘雅医学院动物学部提供，雌雄不限，普通饮食。

主要试剂和仪器

IMDM为Gibco公司产品；新生牛血清购自杭州四季清生物制品研究所；重组小鼠粒巨噬细胞集落刺激因子（rmGMCSF）为R&D公司产品；vWF抗体、CY3标记的羊抗兔IgG为Sigma公司产品；MTT、二甲基亚砜（DMSO）为Sigma公司产品；酶标仪为Awarens公司产品；CO2培养箱购自美国Forma。

小鼠骨髓内皮细胞及内皮细胞集落的培养

用颈椎脱臼法处死小鼠，在无菌条件下取出股骨，用IMDM冲出骨髓细胞，制成单细胞悬液，取1×106个小鼠骨髓单个核细胞种入1ml含有15%新生牛血清的EndoM培养体系，置于24孔板中，于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天后,用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，按每孔1×104个细胞种入24孔板，每组3孔。于二氧化碳培养箱内培养15天后计数内皮细胞集落数，以≥50个细胞的聚合计为1个集落。

内皮细胞的形态观察及vWF的检测

培养的骨髓内皮细胞集落经WrightGiemsa染色后，显微镜下观察内皮细胞形态。用间接免疫荧光法检测骨髓内皮细胞vWF。将内皮细胞培养于24孔板内放置的盖玻片上，当细胞间没有明显的间隙时，取出盖玻片，用PBS清洗，用4%的多聚甲醛固定30分钟，用PBS洗3次：2%的正常羊血清封闭4小时，加入vWF抗体，4℃过夜，用PBS洗3次，加入二抗CY3IgG，37℃孵育60分钟,PBS洗3次：置于荧光显微镜下观察。以本室建的小鼠骨髓内皮细胞株［7］为阳性对照，骨髓成纤维细胞为阴性对照。

不同浓度的GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞形成集落的影响

取纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于24孔板中，每孔5000个细胞，在基本培养体系（含1%浓度EndoM）的基础上分别加入5、10、25ng/ml的rmGMCSF，对照组不加入GMCSF，每组3孔。置于CO2培养箱培养15天，于倒置显微镜下记数集落数，≥50个细胞的聚合计为1个内皮细胞集落。

GMCSF对内皮细胞增殖影响的MTT法测定

将纯化的小鼠骨髓内皮细胞按5000个/孔培养于96孔板，每孔0.2ml，每组3孔。实验组培养体系中分别加入5、25、100ng/ml的rmGMCSF，对照组内不加。在37℃、5%CO2、饱和湿度下分别培养5天和10天，取出培养板吸去培养液，然后加入无血清的IMDM180μl和20μlMTT溶液，放入培养箱孵育4小时，吸去液体，各孔加入DMSO150μl，振荡10分钟，使结晶充分溶解。选择492nm波长，在酶标仪上测定各孔的光吸收值（OD492）。

生长曲线

纯化的小鼠骨髓内皮细胞培养于96孔板中，每孔5000个细胞，加0.2ml含15%新生牛血清的基本培养液，并加入25ng/ml的rmGMCSF。共种6组，每组3孔，培养5天后，分别于第7、9、11、13、15天用胰酶消化后计数细胞，每次3孔，求平均值，做出生长曲线。按公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第1代内皮细胞生长的倍增时间。

细胞周期的流式细胞术检测

无菌条件下取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml培养体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入两种不同培养体系，对照组加含15%新生牛血清的IMDM，实验组加15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，每组各10孔，置于CO2培养箱培养3天后，用胰酶消化细胞，200×g,离心5分钟，用PBS洗涤细胞2次之后，用300μlPBS重悬细胞，加入冰冷的乙醇（-20℃）约700μl（终浓度为70%），将细胞放于-20℃过夜处理后，用流式细胞仪检测细胞周期。

细胞传代培养

取小鼠骨髓单个核细胞，按2×106个细胞种于6孔培养板中（2ml体系中含15%新生牛血清的EndoM），置于37℃、5%CO2、饱和湿度下培养5天，然后吸去培养液，加入15%新生牛血清的IMDM培养液和100ng/ml的rmGMCSF，促使细胞融合，再按1∶4传代于6孔板中，同样加入15%新生牛血清的IMDM和100ng/ml的rmGMCSF，等细胞生长至融合，按1∶4传代，加入相同培养体系。按上述方法传4代后，绘制生长曲线，方法同前。公式DT=t×1g2/(1gN-1gN0)算出第4代内皮细胞生长的倍增时间，并与第1代的倍增时间进行比较。

统计学处理

实验数据为3次结果，以mean±SD表示。不同处理组两组间比较采用t检验，应用SPSS软件分析，P<0.05表示有统计学意义。

结果

细胞形态每孔种入小鼠骨髓内皮细胞5000个，对照组加基础培养液,实验组在基础培养液的基础上分别加入rmGMCSF5、10、25ng/ml。与对照组相比，实验组集落数均明显增多（图3），说明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞的增殖有明显刺激作用。

rmGMCSF对内皮细胞增殖的影响

小鼠骨髓内皮细胞培养5、10天，分别进行MTT的检测，结果表明rmGMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长促进作用明显，各组与对照组相比差异显著（P<0.01）（图4）。

GMCSF对EC细胞周期的影响

运用流式细胞仪检测细胞周期，观察GMCSF对EC细胞周期的影响。结果显示GMCSF使细胞进入S期的比例为9.3%，与对照组2.1%相比有明显差别。此结果说明GMCSF能够促使细胞进入S期，加快细胞的分裂，从而促进了细胞的增殖（图5）。Figure5.EffectofGMCSFoncellcycleofendothelialcells.A:grouptreatedbyGMCSF.B:controlgroup.

体外扩增传代对内皮细胞增殖的影响

图6为小鼠骨髓第1代和第4代内皮细胞的生长曲线。利用计算公式［DT=t×1g2/(1gN-1gN0)］计算出第1、4代细胞生长的倍增时间分别为30.25±0.55小时、31.67±0.26小时。第1代与第4代的细胞倍增时间相比，无明显差异，表明经体外扩增传代4次，仍能保持传代早期的增殖潜能。

Figure6.Growthcurveofthefirstandfourthpassagegenerationsofmurineboneendothelialcells.讨论

国内外对于骨髓内皮细胞的纯化报道较少，但已经进行了一些关于细胞因子对内皮细胞增殖影响的研究，如Yonekura等［8］报道VEGF可以促进内皮细胞的增殖，Rieck等［9］则报道bFGF可促进角膜内皮细胞的生长。我们此前曾报道了VEGF、bFGF、SCF、IL6、GMCSF等对内皮细胞株的增殖有促进作用［10］。GMCSF对未经转化的骨髓内皮细胞增殖的作用尚未见报道。本研究中，我们用本室配制的培养基在较短的时间内纯化了小鼠的骨髓内皮细胞，vWF为阳性，并在此基础上观察了GMCSF对骨髓内皮细胞增殖的影响。应用基本培养基培养内皮细胞集落时，形成的集落数较少，加入rmGMCSF后，集落生成明显增多。MTT的结果亦支持GMCSF对小鼠骨髓内皮细胞生长的刺激作用。细胞生长曲线的结果表明，在含GMCSF培养的条件下，内皮细胞生长的倍增时间为30.25±0.55小时，经4次传代后细胞倍增时间无明显延长，表明体外培养扩增4代后，细胞仍能保持早期的增殖能力，GMCSF对骨髓内皮细胞的体外增殖有明显刺激作用。文献报道内皮细胞表面有GMCSFR的存在，而内皮细胞本身也可以分泌GMCSF［11］。结合细胞周期测定的结果，可以认为，GMCSF促内皮细胞增殖的机制可能是GMCSF与GMCSFR结合，通过细胞内信号传递使更多的细胞进入S期来实现的。

【参考文献】

1LuttunA,CarmelietG,CarmelietP.Vascularprogenitors:frombiologytotreatment.TrendsCardiovascMed,2002;12:88-96

2RafiiS,LydenD.Therapeuticstemandprogenitorcelltransplantationfororganvascularizationandregeneration.NatMed,2003;9:702-712

3ZammarettiP,ZaischAH.Adult‘endothelialprogenitorcells’.Renewingvasculature.IntJBiochemCellBiol,2005;37:493-503

4KalkaC,MasudaH,TakahashiT,etal.Transplantationofexvivoexpandedendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularization.ProcNatlAcadSciUSA,2000;97:3422-3427

5KawamotoA,TkebuchavaT,YamaguchiJ,etal.Intramyocardialtransplantationofautologousendothelialprogenitorcellsfortherapeuticneovascularizationofmyocardialischemia.Circulation,2003;107:461-468

6HristovM,ErlW,WeberPC.EndothelialProgenitorCells:isolationandcharacterization.TrendsCardiovascMed,2003;13:201-206

7王绮如，严燕，汪保和.小鼠骨髓内皮细胞系的建立.中国实验血液学杂志，1997；5：360-366

8YonekuraH,SakuraiS,LiuX,etal.PlacentagrowthfactorandvascularendothelialgrowthfactorBandCexpressioninmicrovascularendothelialcellsandpericyts.Implicationinautocrineandparacrineregulationofangiogenesis.JBiolChem,1999;274:35172-35178

9RieckP,OliverL,EngelmannK,etal.Theroleofexogenous/endogenousbasicfibroblastgrowthfactor(FGF2)andtransforminggrowthfactorsbeta(TGFbeta1)onhumancornealendothelialcellsproliferationinvitro.ExpCellRes,1995;220:36-46

第2篇

经过全面、细致的一轮复习后，学生已基本掌握了教材知识，作为二轮复习的重点则应切实加强对新课程标准和2012年考试说明的研究，以此制定复习目标，这样复习才有针对性和实效性。如：2012年考试说明中对细胞增殖内容的要求。

从近几年的高考来看，命题重点围绕细胞周期中染色体行为和数目变化规律，减数分裂与有丝分裂的比较及图像识别，减数分裂的过程及与遗传的关系。那么学生在这块内容中到底还有哪些未落实到位？又该如何帮助学生有效解决这些问题？

一、典型错误分析

【典例】图为雄果蝇体内某细胞分裂过程中，每条染色体上DNA含量变化(甲曲线)和染色体数目变化(乙曲线)。请据图回答：

(1) CD段细胞中有( )条染色体，DE段有染色单体( )条，FG段细胞中有DNA( )个，DE段可形成四分体( )个。

(2)在A点若用3H标记该细胞的DNA双链，再将其转入不含3H的培养基中

培养，在FG段一个细胞中的染色体总数和被3H标记的染色体数分别为( ) ( )。

(3)若该细胞基因型为AaXbY，在分裂完成后产生了一个AYY的，则另三个的基因型分别为( )( )( )。

(4)该细胞某一条染色体的两条单体相同位点出现不同基因的变化可发生在( )段。

该题考查目标：有丝分裂与减数分裂的曲线辨析，减数分裂中染色体、DNA、单体的数目变化规律，染色体、DNA、脱氧核苷酸链之间的关系，及减数分裂与生物变异的联系。通过学案反映出学生存在以下几方面的问题：

1.基础知识不扎实，记忆不牢，知识点混淆。例如：在第(1)小题中学生由于把果蝇染色体数4对记成了4条从而造成CD段错写为含4条染色体。由于不明确四分体的概

(3)纠错补偏，反思内化。有一句教育的真理“世界上最有价值的习题不是专家出的习题，而是自己做错的习题”。二轮复习抓错题相当机的导航灯一样，它可以帮我们指明前进的方向。学生在一轮复习中已做了大量试题，经历了多次模拟考试，难免出现许多错误，若能指导学生将这些错误进行分类整理，就会发现反复出错的地方就是自己知识上的薄弱环节，这时就可针对性地翻阅书本，结合书本来解决知识漏洞，当然有些错误可能是学生不注意使用生物科学术语回答，画图表、写实验设计不规范严谨等造成的，通过纠错也可有效提醒学生对自己这方面问题的关注。

二轮复习不做题不行，但沉迷于题海也不行，关键要提高做题质量。总结归纳常见题型的解题规律、方法技巧，从而达到弄懂一道题，旁通一类题的目的。也可通过演练近几年的高考真题亲身感触高考题的命题思路、设问方式，从中感悟解题技巧。

3.消除情感梦魇，增强自信。 美国著名心理学家Robert Rosenthal曾做过这样一个实验：他从某个班级的花名册中随意挑选了几个名字，并且告诉老师这些学生经过测试智商较高。之后，老师便关注并鼓励他们，这些学生也由于有了自信而努力学习。八个月之后，那些“高智商”的学生的成绩竟有了惊人的进步。这个实验证实了自信的重要性。那么如何增强学生对考试的自信，以实现从容应考呢？

(1)充分的考前准备：多数学生都有这样的体会：“一看到考题不难，紧张不安的情绪便会随之减少，脑子不再麻木，思维也变得灵活了。”因此，考前一定要做好知识与技能双重准备，并针对考试中可能出现的复杂情况，进行有目的的训练，做到胸有成竹，考试当然也充满信心。

(2)适当的心理调节：既要正确对待压力，但也不能给自己增加压力。不过多去想考试成败将会给自己带来什么后果，尤其不夸大考试成败的影响，树立“天生我材必有用”的广阔意境。

第3篇

原创试题：药物Q可抑制HE细胞增殖，但因有较大毒副作用而使其应用受到限制。为确定另一种能抑制细胞增殖的新药Tet的抑制效果，研究者提出了以下实验思路。

（1）分组。

甲组：培养液+HE细胞+生理盐水

乙组：培养液+HE细胞+ X

丙组：培养液+HE细胞+适宜浓度Tet试剂

每组设置若干个重复样品。

（2）每组样品放置在Y环境中，恒温培养一段时间。

（3）测定每组样品OD值（反应活细胞数量），并统计分析。

（要求与说明：答题时用Q、Tet、OD表示相关名词，不考虑加入药物后的体积变化等误差）

请分析回答：

（1）实验中选择的HE细胞应具 能力。

（2）实验思路中使用的X试剂和Y仪器分别是 、 。

（3）预测实验结果及结论： 。

一、 基于试题素材的分析

1.素材来源

试题背景材料出自《中华实验外科杂志》“粉防己碱对皮肤瘢痕组织细胞增殖和凋亡的影响”。[1]

2.素材选择原因及策略

首先，符合试题命制的真实性原则。试题以科学研究的现实问题为载体，避免学习内容机械化和抽象化，有利于公平、客观地考查学生的知识水平，能有效提高试题的信度、效度和区分度。同时，也体现了生物学知识与技术、社会的联系，渗透STS教育理念。

其次，符合试题命制的新颖性原则。试题情境新颖，紧扣学科前沿，特别是试题中运用的阳性对照这一重要且新颖的思维方法，这有利于培养学生的知识迁移能力和分析、解决实际问题能力，侧重能力考查。

再次，符合生物学新课程倡导的探究性原则。实验是考查学生探究能力的最好平台，是培养学生创新能力的良好途径。结合该试题可以使学生体验科学研究的一般过程，强化科学探究的意识，促进学生学习方式的转变。

二、基于学生答题反馈的分析

（1）分裂或增殖（此处部分学生回答“分化”，主要原因是分裂和分化的概念辨析错误）。

（2）适宜浓度的药物Q（此处部分学生回答“不添加试剂”，主要原因是不清楚药物Q在实验中起阳性对照作用）、CO2培养箱（此处主要有两种错误回答，第一种是回答“恒温培养箱或光照培养箱”，主要原因是混淆植物组织培养和动物细胞培养的差异；第二种是回答卡氏瓶，主要原因是不熟悉动物细胞培养的基本过程，不能灵活应用所学生物学知识）。

（3）由于该实验为探究性实验，所以结果有三种可能性：①若三组OD值，甲>丙>乙，则药物Tet有抑制作用，但抑制效果不如药物Q；②若三组OD值，甲>丙=乙，则药物Tet和药物Q的抑制效果相似；③若三组OD值，甲>乙>丙，则药物Tet抑制效果优于药物Q（此处主要有两种错误回答，第一种是只考虑了其中一种结果，主要原因是将本试题理解成验证性实验，未考虑到实验结果具不确定性。第二种错误回答是同时考虑了药物Tet有无毒副作用和有无抑制效果或抑制效果强弱两个角度，所以出现了6种甚至9种可能结果，主要原因是审题不清，其实题目中已明确该实验目的只是确定能抑制细胞增殖的新药Tet的抑制效果强弱，而无需考虑该药物的毒副作用）。

三、基于试题设计的分析及策略

首先，利用科研论文为试题命制的素材需规避复杂的实验原理和步骤。科研论文是科研成果的体现，而科学研究是一项原理复杂、技术含量高、周期长的工作。本试题素材论文的研究目的是，探讨粉防己碱（Tet）对皮肤创面愈合瘢痕组织细胞增殖周期和凋亡相关基因bcl-2 表达的影响，研究步骤包括建立动物模型及分组、染色观察细胞增殖、检测细胞周期和凋亡蛋白表达率等。背景材料和复杂的实验方法并不是我们的测量目标，对此相关内容在命制试题时应采取规避处理。同时，减少被试者对背景材料的熟知程度，也有利于减少系统误差。[2]但命题者在对材料处理过程中，始终要确保试题科学性，科学性是创新试题的首要标准，否则创意再好的错误命题都是失败的。

其次，试题的语言表述应简洁规范，不存在无效信息。命制原创试题的一个重要策略是试题信息简约化，要有利于被试者进行趋同思维而不产生歧义。这样，一方面可以减少试题阅读量，另一方面使被试者获得清晰的解决问题的信息，才能突显能力考查。[2]为此笔者在命制该试题时，参考了2011年浙江省理科综合高考实验与探究试题的文字表述，但从被试者答题反馈中可以看到，本试题在表述上仍存在不足之处，试题中“有较大毒副作用而使其应用受到限制”就属于无效信息，在一定程度上干扰了被试者的思维方向，这种无效信息可以删除。

再次，在问题设计上应体现知识和能力并举的指导思想。试题考查了实验材料性质、对照方法、动物细胞培养方法和实验结果预测等四个方面。其中实验材料性质和对照组的设计主要考查被试者获取和分析试题信息的能力；动物细胞培养需CO2培养箱考查了被试者利用教材知识解决实际问题的能力；实验结果预测考查了被试者的发散思维和创新能力。在考查学生所学生物学知识的基础上，也侧重对被试者的能力考查。

此外，试题问题设计还应体现层次梯度，遵循从易到难原则，贴近被试者的思维习惯，有利于保证试题的信度和效度。

科研论文极大地丰富了试题命制的素材来源，但创作一道好题，还需命题者具有较强的专业知识和命制技巧，以及对教材的深刻理解和对学生思维习惯的准确把握。科研论文为创作实验与探究纸笔测试题提供了广泛资源和全新视角，以此为素材的命题思路值得继续研究与探索。

第4篇

论文关键词：EM原露在信鸽饲养中的应用

 

“EM”是“有益微生物群”的英文缩写，是日本琉球大学比嘉照夫教授等研究出来的新型复合微生物菌剂，它由光和细菌、乳酸菌、酵母菌等10个属、80多种微生物复合培养而成。国内已有很多厂家生产此类产品。微生物不仅含有较高的优良蛋白质、氨基酸，还有丰富的维生素以及大量的类胡萝卜素、抗病毒物质、生长促进因子和提高群体免疫能力的活性物质，作为添加剂加入饲料中饲喂能促进生长，提高抗病能力。用EM液养禽有提高饲料转化率、促进禽类生长、防治消化道疾病、使饲料脱毒、改善环境卫生、提高繁殖率和幼雏成活率等作用。

一、EM原露的主要成分

1、光合菌群（好气性和嫌气性）。如光合细菌和蓝藻类。具有光合作用和固氮作用。属于独立营养微生物 ，能自我增殖。菌体本身含60%以上的蛋白质 ，且富含多种维生素，还含有辅酶Q10、抗病毒物质和促生长因子；它以土壤接受的光和热为能源，将土壤中的硫氢和碳氢化合物中的氢分离出来，变有害物质为无害物质，并以植物根部的分泌物、土壤中的有机物、有害气体（硫化氢等）及二氧化碳、氮等为基质，合成糖类、氨基酸类、维生素类、氮素化合物、抗病毒物质和生理活性物质等，是肥沃土壤和促进动植物生长的重要力量。

光合菌群的代谢物质可以被植物直接吸收，还可以成为其它微生物繁殖的养分。光合细菌如果增殖，其它的有益微生物也会增殖。例如：VA菌根菌以光合菌分泌的氨基酸为食饵 ，它既能溶解不溶性磷，又能与固氮菌共生，使其固氮能力成倍提高。

2、乳酸菌群（嫌气性）。以嗜酸乳杆菌为主导。它靠摄取光合细菌、酵母菌产生的糖类形成乳酸。乳酸具有很强的杀菌能力，能有效抑制有害微生物的活动和有机物的急剧腐败分解。乳酸菌能够分解在常态下不易分解的木质素和纤维素，并消除未分解有机物产生的种种弊端;合成各种氨基酸，维生素、产生消化酶、促进新陈代谢生物论文，还有融化不溶性无机磷的能力。

乳酸菌还能够抑制连作障碍产生的致病菌增殖。致病菌活跃，有害线虫会急剧增加，植物就会衰弱，乳酸菌抑制了致病菌，有害线虫便会逐渐消失论文的格式。

3、酵母菌群（好气性）。它利用植物根部产生的分泌物、光合菌合成的氨基酸、糖类及其它有机物质产生发酵力，合成促进根系生长及细胞分裂的活性化物质。酵母菌在EM原露中对于促进其它有效微生物（如乳酸菌、放线菌）增殖所需要的基质（食物）提供重要的给养保障。此外，酵母菌产生的单细胞蛋白是动物不可缺少的养分。

4、革兰氏阳性放线菌群（好气性）。它从光合细菌中获取氨基酸、氮素等作为基质，产生出各种抗生物质、维生素及酶，可以直接抑制病原菌。它提前获取有害霉菌和细菌增殖所需要的基质，从而抑制它们的增殖，并创造出其它有益微生物增殖的生存环境。放线菌和光合细菌混合后的净菌作用比放线菌单兵作战的杀伤力要大得多。它对难分解的物质，如木质素、纤维素、甲壳素等具有降解作用，并容易被动植物吸收，增强动植物对各种病害的抵抗力和免疫力。放线菌也会促进固氮菌和VA菌根菌增殖。

5、发酵系的丝状菌群（嫌气性）。以发酵酒精时使用的曲霉菌属为主体，它能和其他微生物共存，尤其对土壤中酯的生成有良好效果。因为酒精生成力强，能防止蛆和其他害虫的发生，并可以消除恶臭。

二、EM原露在信鸽所以中作用

EM原露具有改良土壤、增强光合作用、改善水质、除臭粪、促生长、抗病、改善信鸽品质、抑菌等功效。用EM原露饲养信鸽，有几大好处：

1、提高成活率

⑴使有益菌群迅速在肠道内占据优势，调节肠道内微生态平衡。

⑵对肠道无任何刺激，保护肠道内黏膜。

⑶有效预防雏鸡白痢、大肠杆菌等疾病的发生。

⑷保肝护肾，调节机体内分泌，提高免疫力。

⑷有效促进信鸽生长发育。

通过饲喂EM原露，可大大提高信鸽成活率，提高5~10%。

2、提高免疫力

用EM原露长期饲喂信鸽，可以有效的刺激胸腺、脾脏和法氏囊的发育，提高信鸽的免疫功能，同时能明显增强淋巴细胞的活性，明显增强机体的细胞免疫和体液免疫，从而大大降低疾病防治费用，提高信鸽和肉鸽饲养的综合效益。

3、提高饲料转化率

用EM原露制料长期饲喂，克激活与蛋白质和碳水化合物代谢有关的酶，从而提高它们的效率。使鸽饲料的消化率明显的提高，有助于消化过程。同时能提高鸽子对钙、磷等多种微量元素的吸收利用率。

4、有效减少发病率

用EM原露制作料饲喂信鸽，可以有效的阻止沙门氏菌、大肠杆菌、霉菌、球虫等致病微生物和寄生虫的生长和繁殖，促进有益菌的生长，长期维护肠道微生物菌群的平衡，有效减少发病机率。

5、促进生长，提高品质

通过饲喂EM原露制作料，可明显的促进鸽子的生长发育，提高平均重量，可大幅的提高信鸽的品质。

6、改善饲养环境

用EM原露制作料饲喂信鸽，还可以改善鸽舍环境的功能，使鸽舍内二氧化碳、氨气等有害气体显著减少生物论文，减少量为85%以上。鸽粪臭味明显下降。

综上所述，通过饲喂EM原露制作料，可以大幅提高鸽子成活率，降低信鸽养殖综合成本 20%左右。

三、EM原露在信鸽饲养中的具体应用

EM原露用于信鸽最简单的使用办法，就是按一定比例兑水后直接给鸽子饮用。具体作法是：用1份（毫升）EM原露，1份（克）红糖，加水至一定比例即可。其中红糖是作为一种营养物质，它能保持EM原露中菌群的活力，实际使用中也用过葡萄糖和蜂蜜代替。

1、用于鸽棚及环境消毒

用EM原露，红糖、加250~500倍水配成稀释液喷洒鸽舍及周围环境。开始每星期1次，逐渐减少到15天1次。实际运用中只要把鸽子每天喝剩下的EM稀释液用来消毒鸽舍即可。鸽子饮用EM原露和鸽舍喷洒EM原露一段时间后，鸽舍中的臭味会大大降低，连蚊蝇也会减少很多，这是由于EM原露中的微生物能把促成恶臭的物质：氨、硫化氢、甲基硫醇等当做食物吃掉（分解掉）这无疑给城市阳台的养鸽者带来福音。再不要因为鸽舍产生臭味及引来的蚊蝇与邻居们发生纠纷，城市文明养鸽将落在实处。

2、用于日常保养及防病

用EM原露，红糖，加水配成稀释液给鸽子全天饮用即可，EM原露的用量为每羽信鸽每天0.25~0.5毫升，加水量为100~200倍，以每天刚好饮完为宜论文的格式。原则是冬天增加浓度，夏季减少浓度。其特点是能明显改善整个鸽群体质，对养功差的鸽舍效果尤其明显，鸽群抗病能力增强基本上不民生恶性传染病，消化能力强，粪便形状好，家飞时间延长，飞径半径大，训放整体归巢率高，对照使用注射用氨基酸的鸽群，效果毫不逊色，且成本降低十几倍。

3、防治信鸽体内外寄生虫

其特点是内服不产生毒付作用，非常安全，同时又起到对鸽子身体的保健作用。因此，在比赛期间也能应急使用。外用洗澡也很有特点，有不少鸽友喜欢用高锰酸钾（PP粉）溶于水中给鸽子洗澡，虽然也能起到驱虫，消毒作用，但高锰酸钾是一种强氧化剂，在杀菌的同时也会加速信鸽羽毛的老化，使其失去光泽而干枯。而EM原露中微生物的特点是能产生抗氧化作用的物质，使用它给鸽子洗澡，既能驱虫消毒，又能对鸽子的羽毛起到非常好的护理作用。

EM原露可配制成防虫液，用来驱除鸽子体内外寄生虫。 鸽子体内驱虫时用EM防虫液加500倍水饮用1天生物论文，1星期后再饮用1天即可。驱除体外寄生虫可用EM防虫液加1000 倍水给鸽子洗澡，每星期1次，实际应用中用EM原露直接放在水中给鸽子洗澡，也有驱虫效果，并能使鸽子羽毛油滑光亮。

4、用于治疗鸽病

其特点是简便实用，无论是什么病，不需要做治疗前的医学检验，不用担心会用错药，EM原露对鸽子的消化系统疾病，呼吸系统疾病和一些疑难难症都能治疗，特别是对令鸽友最头痛的多病菌复合有一举多得的效果，同时EM原露治病没有其它化学药剂在治病的过程中产生的毒付作用，抗药性及二次感染等等一系列后顾之忧。而且用EM原露治好的鸽子身体素质恢复极快，这是由于在鸽病治好的同时，鸽子消化系统也已调整到位，这时给鸽子进行营养补充会得到良好的吸收，使鸽子体质迅速恢复。

⑴如果是全棚发生传染性疾病，（如沙门氏菌，新城疫球虫病等）可用EM原露，红糖，（这时不能使用蜂蜜）加水50倍配成稀释液全天饮用，观察鸽子精神状态及烘便，以此判断使用效果，一般3~7天即可完全控制病情，如用后2~3天内无明显效果，可以加大浓度。病情控制后，要继续按治疗浓度饲喂两天，以便巩固治疗效果，然后恢复日常保养浓度。

⑵对病情比较严重或个别发生病情的鸽子，可用EM原露红糖加水10倍配成稀释液，用注射器灌服，每次10毫升每日2~3次，对病情特别严重的鸽子我们的做法是直接灌服EM原露，每次3~5毫升。

⑶对念珠菌，毛滴虫，霉菌感染的信鸽，一般口腔中生有黄白色沉积物，这时要先将沉积物去掉，然后在口腔内滴几滴EM原露，并内服治疗浓度的EM原露，一般2~3天以够治好。

⑷EM原露还可用于防治信鸽饲料的黄曲霉菌中毒，治疗各种原因引起的外伤，眼部啄伤，伤口发炎等具有止血预防感染消炎生物论文，快速愈合创口的神奇效果。

5、用于信鸽赛前赛后的调整和老幼鸽的保健

由于EM原露中的微生物能分泌出有机酸、多糖类、多种维生素、抗生素、各种生化酶、氨基酸和氧等有益物质，既可调正各器官的功能延缓细胞衰老，激活T细胞，分解亚硝基化合物及其它有机化合物，又可增加营养，促进对其它营养物质的吸收，从而改善鸽子体内的微生态平衡，使鸽子保持健康的体质。因此EM原露可用于鸽子的育种，种鸽（特别指高龄鸽）配对前15天，每天灌服10毫升，幼鸽出营后7天至出棚，每天灌服3~5毫升，赛鸽参赛前7天开始每天服10毫升，信鸽比赛归巢后立即灌服20毫升，（此时配羊稀释液时可用蜂蜜代替红糖），之后连服3天，然后转为日常保健浓度饲喂。

注意：在上述调整中，如信鸽出现体重过重，可适当增加信鸽日常训练的运动量，减少饲料中油脂性饲料的比例，其它添加剂均可不用或少量使用，比赛期间可适当给赛鸽增加营养，可选择多种维生素和中草药制剂。

第5篇

【关键词】 雷帕霉素； 肝移植； 冷保存； 再灌注； 胆管上皮细胞； 增殖

【Key words】 Rapamycin; Liver transplantation; Cold preservation; Reperfusion; Biliary epithelial cells; Proliferation

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

兔抗增殖细胞核抗原多克隆抗体、鼠抗pSTAT3tyr705单克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司；ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒为丹麦Dako公司产品；RPM为美国惠氏百宫制药公司惠赠。

1.3 各组术后生存分析

1.4 肝功能指标检测

1.5 兔抗增殖细胞核抗原、α平滑肌肌动蛋白免疫组织化学检测

肝组织常规固定、包埋、切片。采用兔抗增殖细胞核抗原作为细胞增殖期G1S期的评价指标，α平滑肌肌动蛋白作为肌纤维母细胞标志。按ChemMateTM Envision免疫组化试剂盒说明书操作。显微镜下观察α平滑肌肌动蛋白表达阳性细胞的胞质呈棕色，增殖细胞的胞核呈棕色。计算7个高倍镜(×400)视野内，每100个胆管细胞中增殖的胆管上皮细胞所占比例的均值作为该样本的胆管上皮细胞增殖率［4］。

1.6 统计学分析

计量资料以±s表示，所有数据应用SPSS 10.0软件进行统计分析，多组均数间的比较采用单因素方差分析，采用KaplanMeier法绘制生存曲线，Logrank法检验各组生存率之间的差异。

2 结果

2.1 各组术后生存分析

冷保存12 h组生存率明显低于冷保存1 h组(P=0.017 4)，而与雷帕霉素组水平接近(P=0.89，图1)。两组大鼠死亡的主要原因为移植肝肝功能不全，表现为肝脏淤血或伴有局灶性坏死，腹水、黄疸，肝功能酶谱升高，部分死亡大鼠胆管内可见褐色胆泥形成。

图1 各组肝移植术后生存曲线

2.2 各组肝功能检测

2.3 各组胆管上皮细胞增殖

2.4 胆管周围肌纤维母细胞分布

图2 肝移植术后胆管上皮细胞增殖(红色箭头所示为增殖细胞) (2氨基联苯胺染色 ×400)

图3 肝移植术后肌纤维母细胞分布(红色箭头所示为肌纤维母细胞) (2氨基联苯胺染色 ×400)

3 讨论

残存的胆管上皮细胞在对损伤做出再生修复时，虽然最终能恢复到近似原先的细胞形态，但在该过程中极有可能经历DNA损伤或基因序列改变，具有和正常细胞不同的功能，分泌多种与器官纤维化密切相关的细胞因子如TGFβ等，促进胆管周围成纤维细胞活化转化为肌纤维母细胞，而后者的持续出现是器官纤维化过程的关键［6］。同时，大量而活跃的细胞分裂需要消耗较多的能量，就有可能削弱肝内非新生细胞正常的能量代谢过程［7］。这对移植物的长期存活及功能是不利的。我们观察到伴随着明显的胆管上皮细胞增殖，较多肌纤维母细胞环绕于冷保存12 h组胆管周围。这表明严重冷保存再灌注诱导的胆管上皮细胞增殖可能是促进肌纤维母细胞聚集的重要因素。由于胆管上皮细胞和胆管周围肌纤维母细胞之间维持着非常精妙的平衡，冷保存再灌注对胆管上皮细胞的严重损伤触发肌纤维母细胞的大量活化，导致胆管壁创面收缩，增加了胆管壁及其周围组织纤维化和胆管狭窄形成的风险，在肝外胆管或肝内大胆管常表现为管腔狭窄，在小胆管则可能出现管腔阻塞［8］。我们还观察到大胆管尤其肝门附近大胆管内壁的胆管上皮细胞增殖最为活跃，该区结缔组织丰富，内含大量成纤维细胞，极易受到胆管上皮细胞增殖的影响而活化为肌纤维母细胞。这也许正是临床观察到的肝门附近大胆管成为移植肝胆道狭窄易患部位的原因之1，也是影响移植物功能与存活的重要因素。

作为1种新型免疫抑制剂，体外和体内实验均证实雷帕霉素抑制胆管上皮细胞增殖，其有效抑制浓度远低于临床肝移植术后患者应用雷帕霉素作为免疫抑制剂时的血药浓度［9］。我们的研究也发现，雷帕霉素明显抑制由冷保存再灌注损伤诱导的胆管上皮细胞增殖，并减少胆管周围肌纤维母细胞的聚集。雷帕霉素是信号转导及转录激活因子3活化的特异性抑制剂，因而部分阻断转录激活因子3介导的信号通路，从而调控细胞周期进展，影响细胞增殖与分化［10］，这可能是其抑制胆管上皮细胞增殖的分子机制之1。同时我们还观察到，雷帕霉素虽然明显抑制肝移植术后胆管上皮细胞的增殖，但并未降低术后14 d内生存率，进1步提示以胆管上皮细胞增殖为靶点的雷帕霉素极可能成为临床防治移植肝胆管周围纤维化、胆管狭窄等并发症的有力武器，将会更广泛地应用于肝移植领域。

【参考文献】

［2］ Ramadori G, Saile B. Portal tract fibrogenesis in the liver. Lab Invest,2004,84(2):153-159.

第6篇

关键词： 种植体颈部 细菌特点 抗菌技术

在种植修复中，种植体颈部的软组织封闭对种植体成功率有很大的影响。要获得良好的颈部软组织封闭，应该从种植手术后的组织愈合期开始为种植体周围软组织提供一个既有相对无菌的微环境，且又有便于细胞粘附的材料表面。有学者【1】开始研究纳米抗菌材料对人牙龈细胞的增殖和粘附生长的影响。研究结果显示HGF在含10mg/L和100mg/L纳米抗菌材料溶液中持续培养5天，未见其生长与增殖受到明显影响。在l0mg/L和100mg/L浓度的纳米抗菌材料溶液中培养5天的HGF，其亚细胞超微结构正常，胞体内可见吞噬小体，吞噬小体周围膜性结构完整。涂布纳米抗菌材料的表面和光滑纯钛表面上人牙龈成纤维细胞的粘附生长增殖活性差异没有统计学意义（p>0. 05 ），但在扫描电镜中可见涂布纳米抗菌材料的表面人牙龈成纤维细胞有分层生长趋势。综上所述，纳米抗菌材料对人牙龈成纤维细胞的生长与增殖无抑制作用，纳米抗菌材料涂布的表面更有利于人牙龈成纤维细胞的粘附。

又有学者【2】研究氟离子注入钛表面对骨细胞相容性和抗菌性的影响发现氟离子注入表面改性材料没有细胞毒性，利于成骨细胞在其表面的粘附和增殖，，氟离子注入组材料表面成骨细胞粘着斑形成的数量明显多于纯钛组表面，氟离子注入组材料表面成骨细胞I型胶原蛋白形成的数量明显多于纯钛组表面，差异有统计学意义。氟离子注入组材料表面成骨细胞I型胶原mRNA和I型胶原蛋白的表达明显高于纯钛组表面，差异有统计学意义。

有学者发现【3】在口腔生态环境中种植义齿与天然牙牙颈部主要存在18种优势菌，两者无显著差异，其中需氧菌主要为草绿链球菌、卡双球菌等7种，厌氧菌主要为产黑色素类杆菌（占厌氧菌总数的一半以上达56.9%）、口腔类杆菌等11种。龈袋分泌物细菌培养分类计数显示，产黑色类杆菌的数量明显高于种植牙和天然牙颊面颈部的数量达79 %，两者间有显著性差异。产黑色类杆菌是引起牙周炎的主要病菌之一，当其数量与口内其它菌群保持特定的平衡关系时，即可保持口腔生态环境的相对稳定，维持牙周组织健康，进而发挥或恢复牙或种植体正常的生理功能。如因某种原因造成这种平衡关系的破坏，就会产生牙周致病菌的大量增生，这些致病细菌及其产物就可通过主生细菌酶及菌体内毒素而破坏牙周组织。

口腔微环境是细菌适宜的栖息地，大约有700余种细菌构成了一个复杂多样的口腔微生态系统 。其中大约10—20种在破坏性牙周病发病中起作用。目前认为最可疑的牙周致病菌有：伴放线放线杆菌（aa）、牙龈卟啉单胞菌（Pg）、中间普氏菌（Pi）、具核棱杆菌（Fn）等 。研究发现【4】种植体植入后30 分钟即有细菌定植 。早期种植体表面未检测到Aa和Pg两种重要牙周致病菌 ，其余可疑牙周致病菌均有发现。健康的种植体周围球菌的比例较高，厌氧菌和需氧菌的比例较低，牙周致病菌较少检测到。而失败的种植体周围却检测到大量的Aa和Pi，特别是在牙列部分缺失的病人。已有研究表明，种植体周围炎同革兰阴性杆菌相关，包括类杆菌和梭杆菌，螺旋体也在种植体周围炎的发病区域被发现。姜梅杰等【5】通过检测126例患者种植体周菌群，检测出两种新的口腔厌氧菌，即产黑色素普雷沃氏菌和溶血二氧化碳噬纤维菌，检出率分别是54.0% 和31.7%。

学者【6】发现种植体周围的上皮组织也同天然牙一样，由龈沟上皮和结合上皮构成。龈沟上皮构成了种植体防御口腔食物分解产物及细菌、毒素等有害物质侵袭的第一道屏障，这种保护作用不同于一般物理学的封闭，而是类似于一种动态的生物性滤膜（bio-logical filter）。而结合上皮与种植体的紧密附着，构成了软组织防御系统的第二道屏障。种植体周牙龈上皮由数层上皮细胞构成，并形成上皮钉突，细胞之间有较宽的细胞间隙。一些学者利用组织化学的方法对种植体上皮界面进行进一步研究发现，结合上皮与种植体之间存在一层无定形物质，镧盐、过腆酸希夫氏（PAS）染色阳性，提示存在酸性粘多糖和糖蛋白，而酸性粘多糖和糖蛋白正是基底膜的成分之一。底部上皮的细胞厚度为2-5层。

有研究表明【7】种植系统基台的表面粗糙度与菌斑形成密切相关，粗糙的种植体表面常有较多的成熟菌斑，其内含高比例的能动菌和螺旋体 。通常金属表面粗糙度以Ra与Rz值表示，种植体表面光滑度（Ra值）范围0.1～0.3 m，相当于光滑的釉质表面和打磨光滑的修复体。Ra=0.2 txm为表面粗糙阈值，Ra0.2 m时，表面黏附的细菌则明显增加 。Lia等【8】 曾将3种不同粗糙度的纯钛片戴入病人口腔中，24 h后测定细菌的黏附量：Ra≤0.0887 m、Rz≤1.027 Jn时，可以有效减少菌斑的形成。Quirynen等【9】 则把纯钛基台用不同的方法抛光处理后戴人病人口中，结果显示，当Ra

参考文献：

【1】冯琦 纳米抗菌材料对人牙龈成纤维细胞生物学行为影响的体外实验研究 四川大学华西口腔医学院硕士学位论文

【2】刘慧颖 氟离子注入钦表面对骨细胞相容性和抗菌性的影响中国医科大学博士学位论文20080301

【3】刘渝王莉 种植义齿牙颈部细菌生长附着的研究 中国口腔种植学杂志2000年6月第5卷第2期

【4】作者：廖丽斐（综述），钟科，孙 勇（校审） 影响种植体周微生物的因素 西南国防医药2010年10月第20卷第l0期

【5】姜梅杰 郝巧光 王军 人工种植义齿龈沟物厌氧培养结果分析1999（03）

【6】次仁顿珠 姚冬花 结合上皮和结缔组织：种植体与软组织的结合界面及其影响因素 医药杂志2011年第32卷第1期（总第106期）

【7】宿玉成 现代口腔种植学2004

【8】Lia R；Silcia F；Eugenio B The effect of surface roughness on early in vivo plague colonization on titanium1997

第7篇

1PCNA的特点

PCNA是一种分子量为36KD的蛋白质，在细胞核内合成，并存在于细胞核内，为DNA聚合酶δ的辅助蛋白。在细胞核内存在可溶性与不溶性两种PCNA，可溶性PCNA在细胞周期各期中均有表达，其量在DNA合成过程中不发生明显变化，易被去污剂提取、甲醇破坏；不溶性PCNA较稳定，不易被去污剂洗脱、甲醇破坏，这种PCNA在G0～G1期细胞中无明显表达，G1晚期，其表达大幅度增加，S期达到高峰，G2～M期明显下降，其量的变化与DNA合成一致，检测其在细胞中的表达，可作为评价细胞增殖状态的一个指标[1,2,4]。

2肿瘤中PCNA的研究

肿瘤细胞具有旺盛的增殖活性，而PCNA可作为评价细胞增殖状态的指标。因此，国内外在许多肿瘤中进行了PCNA的研究，涉及PCNA与肿瘤发生发展[5,6]、分级[1,7～10]、分期[1,10]、放疗敏感性[11,12]、预后[1,7,8,10,13～20]、复发和转移[1,21]、死亡原因[20]、肿瘤标志物[18,22]等各个方面的相关性，得出了许多结论，但在某些方面因作者和所研究肿瘤的不同，还存在一些争议，即使尚没有争议的结论，也是从一种或几种肿瘤中得出的，这些结论是否适用于所有肿瘤，仍有待进一步研究。

3肺癌中PCNA的研究

PCNA在肺癌中的研究也较多，许多作者致力于这方面的探讨，期望找到有意义、有价值的结果，但到现在为止，PCNA在肺癌中研究所得出的一些结果也同样存在争论[23]。

3.1PCNA与肺癌发生发展的关系

夏书月等[6]在研究肺鳞癌的发生、发展过程中，发现PCNA的表达有逐渐增高，阳性细胞数逐渐增多的趋势。在轻、中、重度不典型增生、原位癌及浸润癌中，PCNA标记指数分别为12.5±8.7、43.3±14.9、68.1±9.1、74.6±8.2、65.4±23.6，与正常和轻、中度不典型增生的上皮相比，浸润癌、原位癌和重度不典型增生的上皮细胞PCNA标记指数明显升高，PCNA阳性细胞数也明显增多。认为PCNA表达为细胞异常增殖的标志，可作为肺鳞癌早期诊断的参考指标。但这仅是在肺鳞癌中的初步探索，且病例数较少，能否作为肺鳞癌早期诊断参考指标，还需进一步验证。

3.2PCNA与肺癌分型的关系

有作者[15,24]认为PCNA在不同类型肺癌中表达不同，鳞癌PCNA标记指数平均约为52％，腺癌为49％，大细胞肺癌为76％，小细胞肺癌为63％。何杰等[25]的结果为：肺鳞癌标记指数为0.51±0.23，腺癌为0.69±0.34。在同一类型不同亚型之间也表达不同。王恩华等[13]在86例肺腺癌中对各亚型进行分析：PCNA在细支气管肺泡癌中表达约为0.22±0.17，腺泡状腺癌中约为0.36±0.12，大细胞癌中约为0.67±0.10。但也有作者认为PCNA的表达仅能反映细胞的增殖状态，与组织学类型无关。Castellano[26]、Fontanini[14]、Fujii[27]等支持这种观点。

3.3PCNA与肺癌分化程度的关系

有研究表明：PCNA表达随肺癌分化程度的增高而减少。王恩华[13]在肺腺癌的研究中发现：高分化组最低，PCNA标记指数约为0.19±0.10，中分化组稍高，约为0.35±0.10，低分化组最高，约为0.55±0.17；何杰等[25]分别分析了肺鳞癌、肺腺癌中PCNA的表达，发现PCNA标记指数与肿瘤分级呈正相关，Zhao等[28]在73例肺癌中得出了同样结论。可见肺癌中PCNA的表达可反映肺癌细胞分化的好坏，预示肿瘤恶性度的高低。这与在许多种其他肿瘤中的研究发现基本一致。

3.4PCNA与肺癌分期的关系

大多数研究表明：PCNA表达与肺癌分期相关，分期愈晚，PCNA表达愈高。Ishida等[29]在211例非小细胞肺癌中统计出Ⅰ、Ⅱ、Ⅲa、Ⅲb期各期PCNA表达平均值分别为30％、24％、40％、50％，有逐渐增高的趋势，但Ⅰ、Ⅱ期差别不大。王恩华等[13]的研究也认为，肺癌中PCNA的表达与N分期及M分期相关，随着分期的增加，PCNA表达增加。但也有作者持相反意见，Fontanini等[14]在周围型非小细胞肺癌的研究中发现，PCNA的表达与分期无关，他们的结果为：T1期PCNA表达值平均约为18％，T2期约为10％。是否是由于在早期（Ⅰ、Ⅱ）肺癌中PCNA表达受宿主免疫系统抑制，变化不明显，而晚期肺癌因免疫抑制减弱，表达明显增加，还有待继续探讨。

3.5PCNA与肺癌血管受侵的关系

Fontanini等[14]在40例周围型，淋巴结阴性的非小细胞肺癌(NSCLC)中发现：PCNA的表达与血管受侵明显相关，有血管受侵组的PCNA表达明显高于无血管受侵组，平均值分别为40％和10％。Fujii等[27]也发现PCNA表达与肺癌血管受侵明显相关。这可能与PCNA高表达者分化差，恶性度高，容易侵蚀血管有关。

3.6PCNA与肺癌预后的关系

部分作者认为：PCNA表达愈低，其生存时间愈长，预后愈好。王恩华等[13]分析了86例手术切除的肺腺癌病例，发现术后存活3年以内组与5年以上组之间，PCNA表达值有显著差异，其标记指数分别为0.42±0.20和0.22±0.15;Ishida等[29]在Ⅰ期NSCLC中也发现，5年生存组中，PCNA(＋)组生存率明显低于PCNA(－)组；Fujii等[26]的研究结果也支持这种观点。但有相当多的作者认为单凭PCNA不能评价NSCLC的预后，Matturri[30]、Monraval[31]、Castellano[26]、Ebina[32]等各自分别研究了PCNA的表达与术后NSCLC生存时间的关系，没找到明确的相关性。考虑这是由于肺癌的预后是由多种因素：如病理类型、病理分期、分化、治疗情况、合并症、年龄、身体状况、PCNA的表达等综合决定的，单凭PCNA这一种因素，难以预测肺癌的预后。

3.7PCNA与肺癌复发的关系

Ogawa等[33]在35例术后复发的Ⅰ期NSCLC中发现，PCNA(＋)组复发时间明显短于PCNA(－)组，中位无瘤生存时间分别为2.5年和4年，认为PCNA可预测Ⅰ期NSCLC术后复发时间的长短。但所研究病例太少，范围狭窄，结果有待进一步证实。

3.8PCNA与肺癌其它标志物的相关性

Fontanini等[14]在周围型肺癌中发现PCNA表达在DNA异倍体中明显高于DNA整倍体，并与异倍体DNAS期分数明显相关，PCNA表达高的分裂指数高于PCNA表达低的。还有研究[13,15,24,28,29,34]表明肺癌中PCNA的表达与细胞构成、DNA指数、AgNORs计数、Ki67等相关。这些多为首次报道，不知结果能否重复，若结论能确证，则无论在临床上，还是基础研究中，PCNA的应用和研究将会更为广泛。

从上可见，肺癌中PCNA的研究已深入到了肺癌的各个方面，但在许多方面所得结果还不统一，造成这种结果不一致的原因很多，初步分析包括以下诸多因素：1)肿瘤本身的因素：肿瘤与肿瘤之间及同一肿瘤不同部位之间，细胞增殖都存在很大的差异[26,36,37]，致使PCNA表达不均。2)取材的影响：由于肿瘤内部不同部位之间PCNA表达不均，取材时可能取到高表达区，也可能取到中表达区或低表达区，以致计数结果不能代表整个肿瘤情况。3)制片过程中的影响因素：组织固定时福尔马林的浓度，固定时间的长短，烤片时温度高低及烤片时间等对PCNA的抗原性都有影响。固定液浓度过高，固定时间过长，烤片温度过高，烤片时间过长均会降低PCNA的抗原性乃致使抗原性消失[1,2]。4)免疫组化染色过程中的影响因素：免疫组化染色过程中所用抗体不同，所得PCNA结果不同；微波炉加热能恢复PCNA的抗原性，增强切片的免疫组化染色效果[37]，使用微波炉处理切片，能增加检测的数值；另外抗体的滴度，内源性过氧化物酶封闭情况，DAB显色时间长短，苏木素衬染的背景深浅等均会影响染片的效果，产生假阴性或假阳性，使检测结果发生变化。5)结果判断的影响：由于每个人所定的阴阳性染色标准不同，选取视野不同，计数细胞总数不同，也造成了一定的人为偏差。

由于实验中存在以上诸多影响因素，不同作者在肺癌中所研究出的结果或在不同肿瘤中所研究出的结果，都难以对照相比，因此PCNA的免疫组化研究有必要采用统一的标准，减少实验误差和人为偏差，使彼此的结果具有可比性。

总之，无论在整个肿瘤方面，还是单在肺癌这一方面，PCNA的研究都是较多的，得出了许多有临床应用价值的结果，但由于肿瘤本身的变异性及人们研究方法的差异，致使所得结果存在一些争议，这有待进一步验证，以便能达到一致的结论，应用于临床，指导临床实践。

作者单位：刘跃平综述汪楣沈瑜殷蔚伯中国医学科学院肿瘤医院放疗科北京市100021

参考文献

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12祝淑钗.食管癌PCNA,CYCLIND表达和DNA含量对术前放疗预后的影响：[学位论文].北京：中国协和医科大学，1997.

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第8篇

[关键词] 胎盘 细胞凋亡 bcl-2 bax ki67

[论文] 人类胎盘不仅在胎儿—胎盘—母体的关系上起中心轴的作用，而且功能上失调会导致母体和胎儿的病理性变化，随着妊娠的进展，绒毛和滋养层不断成熟和分化，已发现许多物质包括原癌基因产物，在胎盘有生理性的表达。胎儿的发展特征是细胞群增殖和诱导或抑制细胞凋亡成熟起来的，因此，胎盘在妊娠期间也经历着相似的变化。我们通过测定胎盘组织中细胞凋亡调控基因bcl-2、bax及细胞增殖基因ki67，进一步探讨了妊娠高血压综合征（PIH）的病理性变化。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选择1998年11月至1999年4月白求恩医科大学第二临床医院及长春市妇产医院妇科门诊及产科病房的孕产妇66例。（1）妊高征组36例，平均26.14±3.42岁，平均孕37.44±3.9周，轻度9例，中度10例，重度17例；(2)正常妊娠组30例，孕早期10例，平均25.25±3.80岁，平均孕9.03±1.11周；孕中期5例，平均26.55±3.93岁，平均孕24.05±3.63周；孕晚期（对照组）15例，平均27.76±3.38岁，平均孕39.82±1.32周。

1.2 标本采集及处理 孕早期是行人工流产术者，孕中期是来自无妊娠合并症、并发症，要求终止妊娠而行水囊引产者，孕晚期为单胎足月初产妇，无妊娠合并症、并发症、以自然分娩及择期剖宫产手主结束分娩，其剖宫产指标主要是头盆不称及社会因素。妊高征组孕妇是无慢性高血压、慢性肾炎及其它心肾疾病的病史者。

早孕绒毛组织不需进一步处理，取出后用生理盐水冲洗净，即用10%福尔马林液固定。中、晚期胎盘组织于分娩后立即在母体面（避开钙化、机化灶）随机取3个不同区域约2cm×2cm×2cm胎盘组织，生理盐水冲洗干净后立即放入10%福尔马林固定液中。

1.3 方法 用免疫组化SP法，抗bcl-2、抗bax、抗ki67单克隆抗体即用型及SP试剂盒均购自福州迈新生物工程公司。每次染色均设阳性和阴性对照。

1.4 结果判定 由2名医师独立观察切片中10个高倍视野。（1）阳性标准：SP法显示bcl-2及bax定位于胞浆和胞膜内，反应产物为棕黄色。根据显色程度分为4级：（-）为无着色，（+）为淡黄色，（++）为棕黄色，（+++）为棕褐色;（2）SP法显示ki67以细胞核呈清晰棕褐色为阳性，按阳性细胞占C-cells的比例分为：阳性细胞数＜10%为（-）；10%-20%为（+）；20%-30%为（++）；＞30%为（+++）。

1.5 统计学分析Fisher精确概率检验法，两组计数资料用等级相关分析。

2 结果

2. 1 正常妊娠期胎盘组织中bcl-2、bax及ki67的基因表达bcl-2表达主要定位在绒毛的S-cells，而bax在S-cells和C-cells均呈阳性，同时在绒毛间质中bax也呈阳性表达，但强度低于滋养层细胞；ki67蛋白主要定位在C-cells。bcl-2在晚期妊娠组的阳性率明显低于早、中期妊娠组（P＞0.05）；ki67在晚期妊娠组的阳性率明显低于早、中期妊娠组（P＜0.01）。早、中、晚期妊娠组bcl-2的表达强度与ki67的表达强度无相关性（P＞0.05），bax与ki67也无相关性（P＞0.05）。

2 .2 妊高征与正常晚期妊娠胎盘组织中bcl-2、bax及ki67的基因表达bcl-2的阳性率在对照组与PIH两组间差异无显著性（P＞0.05），bax两组差异无显著性（P＞0.05），对照组ki67的阳性率明显低于PIH组（P＜0.01）。bcl-2与ki67的表达强度无相关性（P＞0.05），bax与ki67也无相关性（P＞0.05）。

2.3 妊高征胎盘组织中bcl-2、bax及ki67的基因表达bcl-2的阳性率在轻、中、重度PIH3组间差异无显著性（P＞0.05），bax在3组间差异也无显著性（P＞0.05），而ki67在轻度PIH组的阳性率明显低于中、重度组（P＜0.01）。PIH轻、中、重度组妊娠bcl-2的表达强度与ki67的表达强度经等级相关分析无相关性（P＞0.05），bax与ki67也无相关性（P＞0.05）。

3 讨论

3.1 正常妊娠与妊高征胎盘组织bcl－2、bax的基因表达bcl－2是细胞凋亡的重要抑制基因。本研究中免疫组化已确定bcl－2定位在S－cell表达，并且从正常早孕到晚期妊娠持续出现[3，6]，因此保留滋养层细胞团可能是维持妊娠的一种机制[1]。晚期妊娠bcl－ 2表达下降、可能是因为bcl－2正常生理性功能，在孕晚期组成胎盘的细胞不再需要存活，可能是细胞凋亡的一种早期生物学变化，也可能与分娩有关[2]。

目前已知bcl－2和bax是bcl－2家族中重要成员。bcl－2表达水平较高时，可形成bcl－2和bax的异源二聚体，细胞凋亡受到抑制； bax表达水平较高时，可形成bax－bax同源二聚体，加速细胞凋亡。本研究中，对照组bcl－2与bax的阳性率为66．7％与80％，PIH组的阳性表达均为75％，表明大多数胎盘组织均呈bcl－2与bax高表达。bcl－2和bax表达已在一定水平上达到平衡，所以在胎盘组织中不起介导细胞凋亡的主导作用。

PIH组的bax并无随病情的严重程度而有下降的趋势，说明bax会进一步影响妊娠的结局，反映病情的严重程度。这些结果可能提示，胎盘的细胞凋亡并不是bax单独起作用，但有待进一步证实。

第9篇

【关键词】MicroRNA；癌细胞；抑癌基因；癌基因

1 MicroRNA的介绍

MicroRNA一般简写作miRNA ，是一种21-25nt长的单链小分子RNA，成熟的miRNA，5’端有一个磷酸基团，3’端为羟基。它广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA。编码miRNAs的基因最初产生一个长的pri-RNA分子，这种初期分子被剪切成约70-90个碱基大小、具发夹结构的单链RNA前体，并经过Dicer酶加工后生成。成熟的miRNA 5’端的磷酸基团和3’端羟基则是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。

目前只有一小部分miRNAs生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节了细胞生长，组织分化，与生命过程中发育、疾病有关。通过对基因组上miRNA的位点分析，显示其在发育和疾病中起了非常重要的作用。而最近的研究发现，miRNA表达与多种癌症相关，大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点，这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用。同时据推测，miRNA调节着人类1/3的基因。

2 癌细胞的介绍

癌细胞是一种产生了变异的细胞，可以无限生长、转化和转移，能够无限增殖并破坏正常的细胞组织，难以消灭，它是癌症的根源。

大部分细胞的分裂次数是有限的，即“海弗利克极限”。在分裂40-60次之后，细胞的生长速度会下降直至终止，这时细胞就进入衰老期，但是依然存活。这是由于细胞分裂跟端粒有关，如果没有端粒，细胞每分裂一次染色体都会变短，基因信息就会缺失。但是如果存在端粒，每次细胞分裂都会损失端粒的一部分核苷酸，而正常细胞中没有端粒酶，不能正常合成端粒，随着细胞分裂的进行，最后就没有端粒可以保护染色体的末端DNA，所以正常细胞会衰老死亡。而癌细胞中有端粒酶，可以在染色体末端增加端粒DNA。

3 充当抑癌基因作用的miRNA

3.1 MicroRNA-486对肺癌细胞的抑制作用

由俄亥俄州立大学综合癌症中心研究人员Ohio State等人带领完成的一项发表在《美国国家科学院院刊》杂志上的最新研究表明，在肺癌中，microRNA-486是一种强效的抑癌分子，它调节肺癌细胞的增殖和迁移，并诱导程序性细胞死亡或凋亡，但是其在肺癌中的作用机制尚不清楚。

研究人员证实microRNA-486（miR-486）能直接靶向胰岛素样生长因子途径（胰岛素样生长因子是一类多功能细胞增殖调控因子，在细胞的分化、增殖、个体的生长发育中具有重要的促进作用），这一途径对于细胞的存活和增殖具有重要意义，并且研究也表明这一途径发生改变，对于早期肿瘤的发生和发生具有影响。

3.2 miRNA-224及221对大肠癌细胞的生长和转移的抑制作用

大肠癌（colorectal cancer，CRC）又称结直肠癌，是目前在临床上非常常见的一种肿瘤，在国内的发病率处于第三位，而且其发病率仍呈逐渐上升的趋势，是一种导致人死亡的重要疾病。人们对于大肠癌认识不足，因此在临床上发现的大肠癌多数为中晚期肿瘤，治疗效果差，复发率高。

由来自四川大学、美国北达科他大学的研究人员发表在在国际胃肠病学杂志上的论文表明，miR-224及miR-221过客链水平降低，通过上调MBD2，抑制Maspin，促进了小鼠体内的大肠癌生长和转移，它们有潜力成为大肠癌进程的生物标记物，并为开发出靶向性治疗指明了新方向。

3.3 MicroRNA-10a对肝癌细胞的抑制作用

肝癌是一种严重威胁人类健康的疾病，病死率在恶性肿瘤中居第3位。它的发病因素可能是乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）引起的肝炎、肝硬化以及黄曲霉素、化学致癌物等其他因素。

来自天津医科大学和中山大学癌症中心的研究人员发表在在国际著名肝脏疾病杂志Hepatology上的论文表明：一种名为MicroRNA-10a的miRNA通过调控EphA4受体介导的上皮间质转化和细胞粘附，参与了肝癌细胞转移过程。

3.4 MicroRNA-7对胃癌细胞转移的抑制作用

胃癌在我国各种恶性肿瘤中居首位，转移是临床上成功治疗胃癌的一大障碍，大多数胃癌患者的死亡率与转移密切相关，而microRNAs通过调控多种信号通路已成为影响转移的关键因子。在Oncegene杂志上的一项研究表明证实在高转移性胃癌细胞株和肿瘤转移组织中miR-7的表达都显著下调，miR-7表达的增加能降低胃癌细胞的迁移和侵袭能力，而miR-7表达的降低能显著增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。

4 充当癌基因作用的miRNA

4.1 miR-17-92 基因簇作为致癌基因诱导肿瘤发生

现已发现，miR-17-92 基因簇在肺癌、B 细胞淋巴瘤、外套细胞淋巴瘤、肝癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞中均高表达，而且在淋巴瘤、肺癌等多种癌细胞中均存在 miR-17-92 基因扩增现象，其主要是通过抑制抑癌基因和细胞周期调控基因的表达实现的。

4.2 miR-21可能作为胶质母细胞瘤的癌基因

胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，患者预后差，95%未经治疗的患者生存期不超过3个月，对人类的危害很大。

据研究表明miR-21在包括胶质瘤在内的多种肿瘤中高表达，由此表明其可能是癌基因。研究表明，利用互补寡核苷酸抑制恶性胶质瘤细胞的内源性miR-21的功能将导致caspase（Caspase与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节）的活性增加，并导致细胞活性减低。此外，抑制miR-21的功能可以协同增强恶性神经胶质瘤细胞对细胞毒素NPC-S-TRAIL的敏感性。

5 结论与展望