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关键词：黄河故道湿地；土地利用方式；土壤养分；酶活性
中图分类号：S154.2；S158.3 文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2268-05
Characteristics of Soil Nutrient and Enzyme Activities of the Wetland in Old Yellow River of Eastern Henan
ZHU Xin-yua， HU Yun-chuanb
（a.College of Environment and Planning； b.College of Life Science， Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000，Henan， China）
Abstract： Using field sampling and indoor analysis， the effects of different wetland use patterns （saline-alkali wasteland， humid grasslands， marsh wetland， forest wetland） on soil nutrient （soil organic matter， nitrogen， phosphorus， potassium， soil microbial mass） and soil enzyme activities （soil urease， soil catalase， soil invertase， soil alkaline phosphatase） in old Yellow River wetland of eastern Henan were studied. The results showed that soil nutrient and soil enzyme activities had significant difference among different wetland use patterns. Soil nutrient and soil enzyme activities were the highest in the forest wetland， humid grassland and marsh wetland took the second place and saline-alkali wasteland was the lowest. Soil enzyme activities were significantly correlated with soil organic matter， soil microbial mass and soil nutrient， and between soil enzyme activities themselves. Soil enzyme activities varied in the same order as that of soil nutrient. It is indicated that soil enzyme activities could reflect the level of wetland soil fertility， and could be used as an index indicating the soil fertility quality of wetland in old Yellow River.
Key words： old Yellow River wetland； land use patterns； soil nutrition； enzyme activities
基金项目：教育部人文社会科学研究青年基金项目（13YJCZH283）；河南省科技厅科技攻关项目（132102310357）；商丘师范学院青年科研基金项目（2011QN21）
湿地是陆地生态系统的重要组成部分，介于水、陆生态系统之间的一类生态单元，具有水域和陆地生态系统的特点，是地球最富有生产力的生态系统之一[1，2]。近年来，由于人类对湿地资源的不合理利用造成湿地生态系统功能退化，使湿地退化研究及湿地土壤养分和肥力状况成为各国学者关注的热点[3-6]。
湿地土壤退化是个复杂的过程，湿地生态功能是通过物质循环和能量流动来实现的，尤其是养分循环过程，是其生态功能得以实现的重要基础[7]。不同类型的湿地因水文和地上植被的不同，输入土壤的凋落物和根系分泌物不同，因而形成的土壤有机碳库、土壤微生物生物量和土壤养分状况会存在差别。土壤酶参与土壤中各种生物化学过程，是土壤生物过程的主要调节者[8]。湿地土壤酶的存在状态与活性被认为是湿地生态系统中有机物质分解与转化的关键，控制着湿地生态系统物质循环和能量的流动[8]。对于土壤酶活性与土壤养分相关性研究大部分集中在农田生态系统[9，10]、林地生态系统[11，12]、丘陵及草地生态系统[4，13，14]，而对我国暖温带黄河湿地生态系统土壤酶活性与土壤养分的相关性研究较少[7]；特别是对黄河故道不同类型的湿地土壤酶活性与土壤养分含量的关系研究鲜见报道，因此无法全面开展对黄河故道湿地生态功能的维持及退化防治。鉴于此，以豫东黄河故道湿地为研究对象，调查不同类型湿地土壤酶活性、土壤有机质、土壤微生物生物量和土壤养分的分布特征，进一步探讨土壤酶活性与土壤有机质、微生物生物量和养分的相关关系，旨在为黄河故道湿地退化防治、恢复重建和湿地土壤质量的评价提供科学依据。
1研究地点与研究方法
1.1研究区自然概况
豫东黄河故道位于河南省与山东省接壤区，西起民权县睢州坝，东至虞城县小乔集，南北以黄河故堤为界（图1）。故道面积约1 520 km2，为明清时期古黄河水道遗留下的一段洼地，位于115°47′―116°17′E，34°50′―34°33′N，整体走向为西北―东南走向，呈带状分布。故道湿地属于暖温带半湿润大陆性季风气候，年均气温为14.1 ℃，极端最高温为43.6 ℃，极端最低温为-23.4 ℃，年无霜期约210 d，年降水量686.5～872.9 mm。研究区属洪泽湖水系，由山东省单县大姜庄南入安徽省砀山经徐州后入淮河。历代由于黄河的多次泛滥和改道及地下水位不断上升，发育了众多湿地，主要类型为盐碱滩地、沼泽湿地、湿草地、水洼地和林地湿地；湿地土壤多为古黄河冲积沙土或沙壤土。植被类型以草本植物为主，乔木主要有山杨（Populus davidiana）、垂柳（Salix babylonica）、洋槐（Robinia pseudoacacia）、泡桐（Paulownia）等，灌木主要以野生柽柳（Tamarix chinensis）林为主。
1.2研究方法
1.2.1样地设置与样品采集样地选择是在野外植物调查的基础上，依据主要植物群落空间分布特征，利用相关地形林相图及遥感资料，在研究区内设置盐碱滩地（Saline-alkali wasteland，SAW）、湿草地（Humid grasslands，HG）、沼泽湿地（Marsh wetland，MW）和林地湿地（Forest wetland，FW）4种样地类型；每个样点选取3个剖面，分0～20 cm和20～60 cm两层取样，3次重复。将采集的土样拣出所有可见碎石、植物残体和根系后采用四分法混匀装袋，用冰盒运输并保存于4 ℃冰箱中待用。
1.2.2测定项目与方法土壤有机质（SOM）含量用重铬酸钾氧化-比色法测定；土壤全氮（TN）含量采用凯氏定氮法测定；土壤全磷（TP）含量采用高氯酸消化-钼锑抗比色法测定；土壤速效磷（AP）含量采用双酸浸提-钼锑抗比色法测定；土壤速效钾（AK）含量采用乙酸铵浸提-原子吸收法测定，以上项目的测定参照刘光崧[15]的方法。土壤微生物生物量碳（MBC）采用氯仿熏蒸K2SO4浸提-TOC仪测定法测定[16]；土壤微生物生物量氮（MBN）采用氯仿熏蒸浸提-碱性过硫酸钾氧化比色法测定[16]；土壤脲酶（SUR）活性采用靛酚蓝比色法测定，以24 h后1 g土壤中NH3-N的量表示酶活性[mg/（g・d）]；土壤碱性磷酸酶（SAP）活性采用氯代二溴对苯醌亚胺比色法测定，以24 h后1 g土壤中释放出的酚的量表示酶活性[mg/（g・d）]；土壤过氧化氢酶（SC）活性采用高锰酸钾滴定法测定，以24 h内土壤消耗0.1 mol/L KMnO4的量表示酶活性[mL/（g・d）]；土壤蔗糖酶（SI）活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以 24 h后1 g土壤中所含葡萄糖的量表示酶活性[mg/（g・d）]，以上土壤酶活性的测定方法均参照关松荫[17]的方法。
1.2.3数据处理数据采用Excel 2003 和SPSS 16.0软件进行统计分析，Origin 8.0 软件作图；利用ANOVA进行方差分析，利用LSD法进行多重比较。
2结果与分析
2.1不同湿地类型的土壤有机质、养分含量和微生物生物量特征
由表1可以看出，不同样地SOM含量差异极显著（F=42.43，PHG>MW>SAW，且各样地间差异达显著或极显著水平。SOM与MBC和MBN的相关系数分别为0.998和0.999，呈极显著相关，说明SOM含量与MBC和MBN含量关系极为密切。
2.2不同湿地类型的土壤酶活性特征
统计分析表明，4种不同土地利用方式的SUR、SI、SC和SAP活性差异显著或极显著（图2），且4种酶活性的变化规律均表现为FW>HG>MW>SAW，FW各种酶活性均为最高，且显著或极显著高于其他3种类型样地。
2.3土壤有机质、养分含量及微生物生物量与土壤酶活性的相关分析
由表2可知，SOM与4种土壤酶活性均呈显著或极显著正相关，TN与SUR、SC和SI活性呈显著正相关，TP与SUR和SAP活性呈极显著正相关。MBC与4种土壤酶活性均呈极显著正相关，MBN与4种土壤酶活性均呈显著或极显著正相关。AP与SUR、SAP活性显著相关，AK与SUR显著相关，TK与4种土壤酶活性的相关性均不显著。
土壤酶主要来源于土壤动植物和微生物，且与土壤有机质密切相关[5]。相关研究指出脲酶活性变化与土壤含氮量及土壤养分含量相关[18]。土壤磷酸酶活性的高低与土壤中磷的含量关系密切，对土壤中有机磷的分解与转化影响较大[19]。蔗糖酶可以表征土壤肥力质量及土壤熟化程度，对土壤中易溶性的养分物质起着重要作用[20]。本试验中，土壤酶活性与土壤有机质、土壤微生物生物量及土壤养分含量相关性较高，因此，可以用土壤酶活性来指示土壤肥力的高低。
2.4土壤酶活性之间的相关性
由表3可知，不同土地利用方式的土壤酶活性间关系密切，其中，SUR活性与SC、SI、SAP活性之间呈显著或极显著正相关；SC活性与SI活性呈显著正相关，与SAP活性相关性不显著；SI活性与SAP活性呈极显著正相关。黄河故道湿地4种土壤酶活性之间存在不同程度的相关性，说明土壤酶在促进土壤有机质分解与转化及在土壤物质循环和能量流动中存在共性关系。
3结论与讨论
黄河故道湿地不同类型湿地土壤有机质、土壤微生物生物量及养分含量差异显著。盐碱滩地土壤有机质和养分含量均较低，林地湿地最高，湿草地和沼泽湿地居中。这与地上植被类型、有机物质的含量及根系量有关，土壤有机质含量主要决定于地上有机物质的输入量[12]。本研究中林地湿地人为干扰较低，地上植被及庞大的根系量可改良土壤状况，良好的水热条件为地上植被提供了优良的生存环境，导致有机物质的输入量较大；同时，湿地的特殊环境也为有机质的积累提供了良好的条件，使其土壤有机质、土壤微生物生物量及土壤养分含量较高；同时也说明林地湿地在土壤养分积累、分解和转化方面较其他3种湿地类型的土壤有一定的优势。盐碱滩地土壤有机质、土壤微生物生物量和土壤养分含量均较低，这与其长期没有预防治理措施导致的恶劣土壤条件有关；盐碱滩地距离原黄河河道最近，地上植被稀疏，有机物质积累较少，且盐碱化导致的土壤碱性较大，不利于土壤有机质及养分的积累，导致土壤肥力质量退化[21]。
土壤酶活性是土壤功能比较重要的指标，与土壤有机质、土壤微生物生物量和部分土壤养分含量指标间呈显著或极显著正相关，且不同酶活性间也存在显著或极显著正相关，表明土壤酶活性可以反映土壤肥力的高低。土壤酶与土壤微生物和土壤动物代谢产物及植物根系分泌物密切相关，根系分泌物与土壤中微生物和动物含量增加，导致酶活性的增加[7，19]；同时，由于林地湿地土壤有机质含量较高，有充分的营养源维持土壤生物的生存，使土壤生物代谢旺盛，呼吸强度加大，从而使林地湿地各种酶活性较高。郭继勋等[22]研究表明，酶活性随着土壤微生物生物量的增加而不断增强，二者变化基本保持同步。相关研究指出，湿地土壤有机质和土壤理化性质与土壤酶活性之间关系密切[23-26]。本研究中，林地湿地酶活性均较高，且土壤有机质和土壤微生物生物量碳、氮含量比其他3个样地高，这也是林地湿地土壤酶活性较高的另外一个原因。湿草地和沼泽湿地地上有机物质含量不及林地湿地，且与土壤酶活性关系密切的土壤有机质和土壤微生物生物量碳、氮的含量均低于林地湿地，较低的土壤有机质限制了土壤酶的活性[25]。Kang等[8]和Omidi等[5]的研究表明，积水改变了土壤生物群落结构组成，在缺氧条件下，耗氧土壤动物和微生物对土壤有机质的分解速度受到影响，进而影响土壤酶的释放。张文菊等[27]研究证明，含水量高抑制土壤有机碳的矿化，抑制土壤酶的分解作用。由于这些因素的共同作用，导致湿草地和沼泽湿地土壤酶活性低于林地湿地。
土壤脲酶、土壤磷酸酶、土壤过氧化氢酶和土壤蔗糖酶4种酶活性与土壤微生物生物量碳、氮间呈显著或极显著正相关，可能与土壤微生物多样性有关，而土壤微生物多样性又与地上植被类型和多样性有关。因此，深入探讨黄河故道湿地土壤微生物群落特征、土壤动物群落特征、植物群落特征及演替规律及其与土壤理化和生物学性质的关系是今后研究的重点。
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关键词 红壤丘陵区；林龄；马尾松；土壤酶活性；土壤酶指数
中图分类号 S154.2；S718.51 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）15-0165-03
土壤酶是一类具有蛋白质性质的生物催化剂，是土壤生物活动的产物[1]。森林土壤酶在森林生态系统中具有重要作用，参与了土壤中许多重要生物化学过程和物质循环，是表征森林土壤肥力的重要参数，在植被恢复过程中常被用来反应土壤生态系统变化的预警和敏感指标[2-3]。红壤丘陵区是我国侵蚀较严重地区，生态环境极其脆弱[4]。
马尾松以其抗旱、耐瘠薄、生态适应强及防风固沙等特点，在亚热带红壤丘陵地区大量引种、种植，是我国南方的主要造林树种[3]。目前，针对马尾松的研究大多集中在生态系统碳储量[5]、凋落物动态[6]和林地土壤性质[7]等方面，而对于在植被恢复过程中土壤酶活性随林龄变化的研究鲜见报道。
现以不同林龄马尾松人工林为研究对象，分析土壤酶活性随着林龄演变的规律，探讨土壤酶活性对于马尾松造林过程的意义，以期为红壤丘陵区的生态恢复提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 研究区概况
研究区位于江西省鹰潭市余江县（东经116°55′，北纬28°15′）。该区属于中亚热带湿润季风气候区，年均降水量1 794 mm，年均蒸发量为1 318 mm，降水主要集中在4—6月，雨量分配极不均匀，干湿交替明显，平均海拔1 100 m。年平均温17.6 ℃，年平均日照时数1 809 h，≥10 ℃有效积温为5 528 ℃，年均无霜期262 d。该区地形以岗地为主，海拔在35～60 m，坡度为5°～8°，土壤类型以第四纪红黏土发育而成的典型红壤为主。本研究以马尾松（Pinus massoniana）林为研究对象，林下植被主要有芒（Dicranopteris dichotoma）、白茅草（Imperata cylindrica）和野谷草（Arundinella hirta）等。
1.2 研究方法
1.2.1 土样采集。2012年4月，在野外详细调查的基础上，采用空间代替时间法，选择营林、管理方法及坡位、坡向和土壤母质一致的6年（PM6）、12年（PM12）、16年（PM16）、20年（PM20）、25年（PM32）、30年（PM30）和45年（PM45）马尾松人工林为研究对象，选取裸地（CK1）和天然次生林（CK2）为对照样地（表1）。在20 m×20 m不同林龄马尾松样地内用“S”形采样法选取5点，利用土钻取0～20 cm厚的土样，每个土样3次重复。将每个土样去掉石砾、动植物残体及杂质后，混匀，四分法留取约500 g土样，将土样分成2份装入塑封袋内带回实验室。一份存于4 ℃冰箱内用于土壤酶活性测定分析，另一份自然风干，研磨，分别过1.00、0.25 mm筛，用于土壤理化性质分析。
1.2.2 样品测定。土壤pH值、有机质、全氮、全磷、碱解氮、速效磷和速效钾含量采用《中华人民共和国林业行业标准方法》测定[8]。蔗糖酶、脲酶、酸性磷酸酶、过氧化氢酶和多酚氧化酶活性具体测定方法参照《土壤酶及其研究法》[9]：蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，以24 h后1 g土壤中含有的葡萄糖量（mg）表示；脲酶活性采用苯酚钠—次氯酸钠比色法测定，以24 h后1 g土壤中NH4+-N量（mg）表示；酸性磷酸酶采用Hoffman法测定，以12 h后1 g土壤所消耗酚量（mg）测定；过氧化氢酶采用滴定法测定，以 1 g土壤20 min后消耗0.1 moL/L KMnO4量（mL）表示；多酚氧化酶活性采用典量滴定法测定，以1 g土壤滤液的0.01 moL/L I2体积（mL）数来表示。
1.3 土壤酶指数（Soil enzymes index，SEI）计算方法及相关数据分析
为了全面揭示不同林龄马尾松人工林土壤酶活性的变化规律，进一步采用土壤酶指数（SEI）说明土壤酶活性在植被恢复过程中的演变特征[1]。土壤酶计算公式[2]如下：
SEI=■wi×SEI（xi）（1）
wi=Ci/C（2）
SEI（xi）=（xi-ximin）/（ximax-ximin）（3）
SEI（xj）=（xjmax-xj）/（xjmax-xjmin）（4）
式（1）～（4）中，wi为土壤酶（i）的权重，Ci为公因子方差，C为公因子方差之和；SEI（xi）为升型酶（i）的隶属度值，SEI（xj）为降型酶（j）的隶属度值；（xi）表示土壤酶（i）的活性值，（xj）表示土壤酶（j）的活性值。ximax和ximin分别表示土壤酶（i）活性的最大值和最小值。xjmax和xjmin分别表示土壤酶（j）活性的最大值和最小值。多酚氧化酶采用降型分布函数对土壤酶指数进行计算，其他酶采用升型分布函数对土壤酶指数进行计算。相关性分析及差异性比较采用SPSS13.0（SPSS Inc.，USA）软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同林龄马尾松人工林地土壤酶活性变化特征
不同林龄马尾松林地土壤养分特征见表2。研究结果表明，裸地在种植马尾松6年后，土壤中蔗糖酶含量显著增加，在种植12～20年时土壤中蔗糖酶活性呈相对稳定趋势，25年后开始稳定增加，到45年达到最大，是CK1的2.55倍，但仍低于天然次生林土壤蔗糖酶活性（表3）。
裸地种植马尾松后，土壤酸性磷酸酶活性显著增加，随林龄增加呈上升趋势，到45年达到最大，是CK1的5.76倍，为天然次生林（CK2）的92.3%（表3）。
土壤过氧化氢酶的变化趋势和酸性磷酸酶类似，裸地种植马尾松后土壤过氧化氢酶活性显著增大，在种植6～25年时，保持相对稳定，32年后逐渐增加，到45年达到最大，但仍低于天然次生林（CK2）的（3.38±0.12）mL/g（表3）。栽植马尾松后，土壤脲酶活性增幅达到显著水平，随着植被种植年限的增加，土壤脲酶活性呈上升趋势，到45年达到最大，是CK1的3.88倍，仍低于天然次生林，但二者之间差异并不显著（表3）。
过氧化氢酶活性变化趋势与蔗糖酶相似，与CK1相比，不同林龄过氧化氢酶活性均显著增加，且随着林龄的增加呈上升趋势。多酚氧化酶随着马尾松种植年限的增加呈现递减趋势，到45年时达到最低值，仅占CK1的41.9%，但仍然高于天然次生林（CK2）（表3）。
2.2 土壤酶活性与土壤养分相关性分析
土壤酶活性与土壤养分相关性分析表明（表4），蔗糖酶与有机碳、全氮、碱解氮、有效磷和速效钾呈极显著正相关（p
2.3 土壤酶指数（SEI）
由前面对土壤酶活性随林龄变化的分析可知，马尾松林龄对土壤酶活性的影响随土壤酶类型的不同而有一定的差异。为了克服单一土壤酶指标反映土壤性质变化的缺点，引入土壤酶指数作为各酶因子的综合作用的反映，从而能更加客观、全面地反映土壤酶活性在整个植被恢复过程中的变化。研究结果表明（图1），裸地种植马尾松6年后，SEI呈显著升高趋势，在种植12～20年时保持相对稳定，在种植25年后又开始稳定升高，到45年达到最大，是CK1的2.64倍，但低于天然次生林（CK2）。
3 结论与讨论
3.1 土壤酶活性
土壤酶能催化土壤中的生物化学反应和物质循环，其活性的高低可以反应土壤的肥力状况[10]。林龄主要是通过对土壤理化性质、生物区系和土壤水热状况的改变，从而间接影响土壤酶活性[3]。张 超等[1]对黄土高原丘陵区植被恢复过程中土壤酶活性的研究表明，植被恢复过程中土壤中脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶活性显著增加，但仍然低于天然侧柏林，而多酚氧化酶的活性随着马尾松林龄的增加而降低。
本研究结果表明，土壤多酚氧化酶活性也随林龄的增加而降低，与葛晓改等[3]、谭芳林等[11]的研究结果一致；其他酶活性随林龄的增加而呈总体上升趋势，与张 超等[1]的研究结果类似。土壤蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和纤维素酶活性随马尾松种植年限增加而增加，这可能是因为红壤丘陵区低质土壤在种植马尾松后，根系能够固定土壤，减少水土流失，同时大量的枯枝落叶返回土壤，增加土壤中的有机质和营养元素含量[1]；同时，随植被恢复年限的增加，林下植被种类增多，能为土壤微生物提供更多的营养物质，土壤酶活性因而得到提高[12]。土壤多酚氧化酶随着马尾松林龄的增加反而降低，这可能是因为土壤无机氮利用率的提高，改变了土壤微生物的群落结构，导致了土壤多酚氧化酶活性的降低[13-14]。
3.2 土壤酶活性与养分相关性
在植被恢复过程中，土壤酶在改善土壤质量中扮演着极其重要的角色，它们能直接影响土壤养分的转化和代谢过程，可以作为土壤肥力的评价指标[1-2]。Duran et al[15]认为，纤维素酶和土壤中有机质和氮含量之间有着密切的关系，土壤有机质性质决定纤维素酶活性。葛晓改等[3]对红壤丘陵区不同林龄马尾松林土壤养分和酶活性关系研究表明，马尾松土壤养分与土壤酶活性关系密切，土壤有机质含量越高，转化酶活性越高。张 超等[1]对黄土丘陵区不同林龄人工林刺槐林土壤酶演变特征研究表明，土壤酶与土壤养分因子相关性较强。
本研究结果也表明，土壤酶与土壤养分因子之间存在密切关系。因此，土壤蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶、纤维素酶和多酚氧化酶可以作为土壤肥力和质量的生物学评价指标[16-17]。
3.3 土壤酶指数
土壤酶是较为理想的土壤质量指标，在进行土壤肥力评价时，可以作为土壤肥力状况的评价指标。但利用单一酶类反映土壤酶活性变化，这存在很大的片面性和局限性，土壤酶指数（SEI）可以克服这一缺点，能更加客观、全面地反映土壤酶活性随植被恢复的演变特征。张 超等[8]在对黄土高原丘陵区植被恢复的研究表明，土壤酶指数随植被种植年限的增加而增加，结果认为土壤酶指数可以作为一种土壤肥力评价指标。
本研究表明，在植被恢复过程中，土壤酶指数随马尾松林龄的增加呈上升趋势，45年龄的为裸地上的2.64倍，但仍低于天然次生林的土壤酶指数。
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要：采用黄绿木霉T1010 （Trichoderma aureoviride 1010） 制剂处理日光温室番茄连作土壤，以常规生产区为对照，设黄绿木霉T1010和1/2黄绿木霉T1010两个处理，通过对土壤酶活性比色法测定，研究其对耕层土壤酶活性的影响，为应用黄绿木霉T1010改善土壤生态环境，促进番茄生长发育提供理论依据和技术支持。结果表明，不同处理条件下土壤酶活性不同，其中纤维素酶、几丁质酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶、多酚氧化酶活性大小顺序为：黄绿木霉T1010〉1/2黄绿木霉T1010〉CK；蔗糖酶、淀粉酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性最高的处理是1/2黄绿木霉T1010；对照处理的土壤中葡聚糖酶活性最高。ANOVA分析，除葡聚糖酶和蛋白酶，其他各处理酶活性差异显著。可见，黄绿木霉T1010对土壤中酶活性有一定调节作用，改善土壤生态环境，有效促进番茄根系的发育，进而促进番茄产量的形成。
关键词：黄绿木霉T1010；土壤酶活性；水解酶；氧化还原酶；调控
中图分类号： S144.9
文献标识码：A
DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2013.01.005
Regulating Effect of Trichoderma aureoviride 1010 on Enzyme Activity in the Solar-greenhouse Soil
CHEN Jian-ai1， CHEN Wei-jing2， YANG Huan-ming3， ZHU Wen-ting2，4
（1. Institute for Application of Atomic Energy and Institute of Agro-food Science and Technology， Shandong Academy of Agricultural Science，
Ji'nan， Shandong 250100，China； 2. High-tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Science， Ji'nan， Shandong 250100，China； 3. Agricultural Department of Shouguang City， Shouguang， Shandong 262700，China； 4. College of Life Science， Shandong Normal University， Ji'nan， Shandong 250014 ，China）
Abstract：
In this study， the effect of Trichoderma aureoviride 1010 （T1010） on soil enzyme activity was determined， and hope to gain information for the application of T1010 to regulate the soil in solar-greenhouse. The experiments were carried on the soil in solar-greenhouse of Shouguang with tomato continuous cropping from August 1 to December 31 in 2009， and the experiment had two treatments （T1010 and 1/2T1010） with conventional production areas as control. These enzymes were analyzed by colorimetric method. Cellulose， chitinase， phosphatase， urease， protease， polyphenol oxidase， these enzymes activity of soil were always significantly greater， often by T1010， in 1/2T1010 than CK. The invertase， amylase， catalase and peroxidase activity were the highest in 1/2T1010. The dextranase activity increased in control. It showed that T1010 could enhance the solar-greenhouse soil environment efficiently by regulating soil enzyme activity. And they could promote the yield formation and product quality improvement of tomato by making good influence on the growth of roots， stems and leaves.
Key words： Trichoderma aureoviride 1010； soil enzyme activity； hydrolytic enzyme； oxido-reductase； regulation
土壤酶是一类具有特殊催化能力的较稳定的蛋白质，是一种生物催化剂，主要来源于土壤微生物和植物根系的分泌物及动植物残体的分解释放，包括水解酶类、氧化还原酶类、转移酶类和裂合酶类等[1-3]。其中，水解酶包括各种脂类酶、糖苷酶和肽酶，能够解聚多糖、蛋白质等大分子物质，从而形成简单的、易被植物吸收的小分子物质，对于土壤生态系统中的碳、氮循环具有重要作用。氧化还原酶主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。在此类土壤酶中，过氧化氢酶能酶促过氧化氢的分解，有利于防止过氧化氢对生物体的毒害作用；多酚氧化酶参与土壤有机组分中芳香族化合物的转化，能够反映土壤腐殖质化状况[4-5]。
土壤酶活性反映了土壤中各种生物化学过程的强度和方向，在土壤发生发育、土壤肥力形成、土壤净化及生态系统的物质循环过程中起着至关重要的作用[6-7]。研究表明，土壤酶的活性与土壤微生物数量密切相关[8-9]。本研究密切关注日光温室番茄生产中面临的土壤连作障碍导致的土壤酶活性降低的现状，依据环境土壤学理论，采用环境友好型微生物黄绿木霉T1010 （Trichoderma aureoviride 1010） 制剂处理日光温室番茄连作土壤，环境变化对土壤酶活性的影响。研究黄绿木霉T1010在日光温室耕层土壤中强势定殖后对水解酶和氧化还原酶两大类土壤酶活性的调控效应，为应用黄绿木霉T1010改善土壤生态环境，提高土壤酶活性，促进番茄生长发育和产量形成提供理论依据和技术支持。
1
材料和方法
1.1
供试材料
供试番茄品种为从以色列引进的日光温室专用番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）品种“Aima701”。
供试黄绿木霉T1010 （Trichoderma aureoviride 1010） 制剂由山东省农业科学院原子能农业应用研究所利用60Co -γ射线和紫外线复合诱变选育后利用稻壳进行固体发酵而成。
1.2
试验设计
试验于2009年8月至12月安排在山东省寿光市多年连作种植番茄的代表性日光温室中进行，试验以常规生产区（分别按7 500 kg·hm-2用量施用腐熟的鸡粪和豆饼）为对照，设黄绿木霉T1010处理（在常规生产区的基础上，按225 kg·hm-2用量施用黄绿木霉T1010制剂，在黄绿木霉T1010处理单因素差异的条件下研究其对水解酶和氧化还原酶两大类土壤酶活性的调控效应）和1/2黄绿木霉T1010处理（在常规生产区的有机肥用量减半的基础上，按112.5 kg·hm-2用量施用黄绿木霉T1010制剂，用以研究在投入成本与对照基本一致的情况下对土壤酶活性的影响）。将黄绿木霉T1010制剂和有机肥在番茄移栽前 15 d 施入日光温室耕层土壤，并进行灌溉。对照和处理各重复4次，共设12个小区，每个小区种 6 行番茄，行长 9.6 m，行距 0.6 m，株距0.36 m。
1.3
栽培管理
2009年8月1日，将5叶期的番茄幼苗移栽于日光温室，每株留5～6穗花，每穗坐果数自由生长不控制。每月随灌溉按750 kg·hm-2用量追施复合肥（16% NH4+，13% P2O5，16% K2O）。通过人工控制放风口大小和放风时间使日光温室室内温度保持在白天（25±5） ℃，夜间（14±2） ℃。
1.4
日光温室耕层土壤酶活性指标测定
2009年11月26日对各处理和对照的耕层土壤进行取样。处理和对照均采用5点取样法，每点取5～15 cm、15～25 cm 各1环，10环土样混和存放在密封的铝盒内，带回实验室作冷冻保存，用于土壤酶学指标测定。
土壤水解酶活性为蔗糖酶以蔗糖为基质，淀粉酶以可溶性淀粉为基质，纤维素酶以羧甲基纤维素为基质，葡聚糖酶以葡聚糖为基质，采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定释放的葡萄糖含量[1]，几丁质酶以胶状几定质为底物比色测定N-乙酰氨基葡萄糖含量[10]，脲酶以尿素为基质比色测定NH3-N释放的量[1]，蛋白质酶以干酪素为基质茚三酮法比色测定释放的甘氨酸含量[1]，磷酸酶以磷酸苯二钠为基质比色测定释放的酚量[1]；土壤氧化还原酶活性为过氧化氢酶酶解过氧化氢钼酸铵显色测定[9]，过氧化物酶、多酚氧化酶以邻苯三酚为基质，着色乙醚相比色测定紫色没食子素量[1]。
1.5
统计分析
试验数据采用SAS 8.2 分析软件对不同处理间的差异显著性进行ANOVA分析，以Pr>F
2
结果与分析
2.1
黄绿木霉T1010对日光温室耕层土壤水解酶活性的调控效应
番茄生长盛果期，对日光温室不同处理土壤取样，对土壤水解酶活性指标检测结果显示（表1），黄绿木霉T1010处理的土壤淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶活性分别比对照提高7.79%，14.29%，13.95%，16.67%，1.5%，16.67%，蔗糖酶、葡聚糖酶活力比对照各降低4.32%，8.54%。1/2黄绿木霉T1010处理的日光温室土壤蔗糖酶、淀粉酶活性分别比对照提高7.00%，15.40%，纤维素酶、葡聚糖酶、几丁质酶、脲酶、蛋白酶、磷酸酶活性则比对照降低，降低幅度分别为31.75%，13.03%，2.32%，8.33%，0.19%，8.33%。进一步进行 ANOVA 分析结果显示，不同处理间酶活性差异均达极显著水平，结果分别为，蔗糖酶：Pr>F=0.008 7；淀粉酶：Pr>F=0.008；纤维素酶：Pr>FFF=0.006 5；磷酸酶：Pr>FF=0.374 2；Pr>F=0.520 2）。Duncan 新复极差测验的结果（表1）进一步显示了不同处理相互之间差异的状况。
2.2
黄绿木霉T1010对日光温室耕层土壤氧化还原酶活性的调控效应
对日光温室不同处理土壤氧化还原酶活性指标检测结果显示（表2），黄绿木霉T1010处理的日光温室过氧化氢酶（CAT）活性比对照提高3.07%，过氧化物酶（POD）活性比对照降低1.64%，多酚氧化酶（PPO）活性比对照提高5.07%；1/2黄绿木霉T1010处理的CAT活性比对照提高5.73%，POD活性比对照提高4.37%，PPO活性与对照相当。酶活性不同处理间均有差异，结果分别为，CAT： Pr>FF=0.055 2；PPO：Pr>F=0.030 3。Duncan 新复极差测验的结果进一步显示了不同处理相互之间差异的状况。
2.3
黄绿木霉T1010对日光温室番茄根系生长和产量形成的影响
对不同处理番茄植株根系生长指标检测及ANOVA 分析的结果表明（表3），不同处理间主根长、侧根长、侧根数差异显著（Pr>F
对不同处理番茄植株主要产量形成指标检测及ANOVA 分析结果（表3）表明， 不同处理间单果枝坐果数、单果质量、产量等指标差异显著（Pr>F
观测结果显示，黄绿木霉T1010处理的日光温室番茄植株坐果早、成熟早、果实大、着色均匀、果形一致。
3
结论和讨论
随着土壤酶和微生物新的测试技术的发展，人们已经清楚地认识到土壤酶活性与土壤微生物之间存在着密切关系。Aon曾指出，一般情况下特定的土壤酶活性与细菌和真菌类群关系密切。一些研究表明，放线菌能释放降解腐殖质和木质素的过氧化物酶、酯酶和氧化酶等[12-14] 。Naseby等[15]的研究表明，木霉属和腐霉属增加了与C、N、P循环有关的沙壤土上的酸性和碱性磷酸酶、脲酶、广葡聚糖酶、纤维素分解酶和几丁质酶活性。汤树得[16]研究白浆土生物活性时发现，脲酶、蔗糖酶、过氧化氢酶与微生物的活性有直接性关系。陈放鸣等[17]研究发现土壤微生物活性与磷酸酶活性呈正相关。胡海波等[18]的研究表明，真菌数量对磷酸酶、脲酶和蛋白酶的影响很大，细菌和放线菌数量对蔗糖酶有显著影响，土壤微生物的数量与土壤酶活性有一定的相关性。丁菡等[19]在对半干旱区土壤酶活性与微生物关系的研究中发现，土壤微生物数量与各种土壤酶活性之间都有较高的相关性。
本研究的结果表明，环境友好微生物黄绿木霉T1010可在日光温室耕层土壤中强势定殖后对土壤水解酶和氧化还原酶两大类土壤酶活性有调控效应，其中，对大部分水解酶提高了其活性，少数水解酶活性降低，比如葡聚糖酶，对过氧化氢酶、过氧化物酶、多酚氧化酶提高幅度较小。在土壤有机质比较充裕的情况下，黄绿木霉T1010对日光温室土壤中水解酶和氧化还原酶等酶活性均有不同程度的积极的影响。
黄绿木霉T1010制剂处理日光温室番茄连作土壤，可在日光温室土壤，特别是番茄根际快速定殖，长期存活，有效提高土壤酶活性，改善土壤生态环境，进而促进了日光温室番茄根系的生长、产量的形成和品质的提高。
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关键词：重金属；脲酶；镉；铅
土壤是人类的衣食之源和生存之本，即使是现代经济生活中，土壤依然是最基本的生产要素和各种经济关系的载体[1]。随着工业的发展和农业生产的现代化，环境污染问题日益严重，大量的重金属污染物进入到土壤系统中。但是由于土壤的自净能力有限，当污染物的含量超过了土壤容量时，就会对生态环境和人类健康造成严重的影响，甚至威胁到人类的生存[1]。其中土壤重金属污染的问题已经成为全球各国共同面临的棘手问题。
土壤酶是土壤中稳定的具有某种特殊催化能力的一类蛋白质[2]。土壤中与物质和能量转化有关的生物化学过程都是在土壤酶的作用下进行的，因此它们在土壤养分的转化、循环和利用及降解土壤中有毒物质、消除土壤污染等方面发挥着重要作用[3]。国内外众多学者已开始研究利用土壤酶活性评价土壤重金属污染的可行性，并取得了显著进展。
一、材料与方法
1、供试土壤
供试土壤为棉花地，采自于北辰区的被人为影响较弱的的农田里，经实验室实验检测重金属含量不超标，属于自然无污染土壤。将取来的新鲜土样弄成碎块，放在室内阴凉通风处自行干燥。干燥后的土壤研磨过200目尼龙筛，并置于塑料袋内，放于室内备用。
2、添加外源铅、镉土壤污染实验
称取150g干土的新鲜土壤样品，用蒸馏水调节土壤含水量至田间持水量40%，装于500 ml的塑料烧杯中，用具有透气性能的薄膜封口，于25℃生化培养箱内预培养3周。然后根据处理要求将重金属溶液与土壤充分混匀，调节土壤含水量至田间最大持水量60%，薄膜封口，于25℃培养箱内培养。培养过程中为了保持土壤湿度不变，用称量差减法每隔3天调节一次土壤水分。整个培养试验持续52天，分别于第3、10、17、31、52天取样测定土壤脲酶活性。
Cd 以CdCl2・2.5H2O形式投加，Pb 以Pb（NO3）2 形式投加，将CdCl2・2.5H2O 和Pb（NO3）2 粉末溶于水后与土壤充分混匀。本实验共设16个处理，分别为L1（CK）、L2（Pb50）、L3（Pb200）、L4（Pb400）、L5（Cd5）、L6（Pb25）、L7（Pb50）、L8（Pb50Cd5）、L9（Pb50Cd25）、L10（Pb50Cd50）、L11（Pb200Cd5）、L12（Pb200Cd25）、L13（Pb200Cd50）、L14（Pb400Cd5）、L15（Pb400Cd25）、L16（Pb400Cd50）。
3、土壤酶测定方法
脲酶活性测定采用土壤酶研究法[4]。
二、结果与讨论
1、镉、铅单一污染对脲酶活性的影响
脲酶在外源重金属 Pb的情况下，添加低浓度的Pb（50）对脲酶活性有激活的作用，而随着添加重金属浓度的增加脲酶活性不断的降低。当Pb浓度为50mg/kg时，对脲酶活性为激活作用，其平均激活率为12.34%；当Pb浓度为200mg/kg和400mg/kg时，对脲酶活性为抑制作用，其平均抑制率为12.47%和31.52%。脲酶活性的抑制百分数随着重金属的浓度增大而递增，而且这种递变规律在重金属加入量较高时更明显。不同Pb 处理在土壤培养中期（17天左右）脲酶活性最高，随着培养时间的延长酶活性有降低的趋势，酶活性的最低值出现在第52天。
脲酶对重金属Cd元素的反映非常敏感，添加不同浓度的Cd后，立刻表现出强烈的抑制作用，随着浓度变化越大，其抑制率也会越大，其抑制率分别为6.32%、11.62%、21.32%。培养初期和中期酶活性相对比较高，到末期（52天）其活性到了最低点。
2、镉、铅复合污染对脲酶活性的影响
土壤样品中脲酶活性几乎都随着重金属添加量的增加而降低。在铅、镉复合污染下，脲酶活性随重金属浓度增加而减小。由于铅单一污染的时候，对脲酶活性大部分都是促进作用。所以土样L8、L11、L14与CK对比则产生了激活的作用，剩下的土样则产生了抑制作用。在铅、镉复合污染下，脲酶活性的变化与单一铅污染变化比较相似，并且高于单一镉污染。在培养时间段初期，脲酶活性的净变化量=U均小于0，且接近于0，铅和镉复合污染表现出轻微的拮抗作用，即铅和镉复合污染的毒性因为铅的存在而减弱。随着培养时间的延长（到后期），=U大于0，铅和镉的复合污染表现出协同作用，即铅和镉复合污染的毒性因为铅和镉的加入毒性更大了，所以脲酶的毒性程度呈现出铅和镉复合污染>镉单一污染>铅单一污染。
3、土壤重金属的全量及各形态对土壤酶活性的影响
可交换态 Pb对脲酶具有轻微的激活作用，激活作用不是特别明显，呈相对不显著正相关。Pb的其他态和全量对脲酶都产生了比较明显的抑制作用，其中碳酸盐结合态的抑制作用最为明显R值为0.447，其次是全量、有机态、残渣态、铁锰氧化态。
总量和各个形态的Cd对脲酶都具有相对明显的的抑制作用，负相关显著。其中铁锰氧化态和碳酸盐结合态的抑制率最高，R值都达到了0.905，最低的是残渣态。通过对比可以看出重金属Cd的毒性远大于Pb，重金属Cd对环境的危害性最大，所以用脲酶活性作为判断土壤的污染程度是比较可行的方案。
三、结论
通过实验室外源添加重金属Pb、Cd发现，低浓度的Pb对脲酶有激活作用，随着添加浓度越来越高酶活性就有明显的降低趋势。Cd对脲酶有强烈的抑制作用，通过分析发现两种重金属的毒性强度为Pb、Cd复合污染>Cd单一污染>Pb单一污染。通过对比可以看出重金属镉的毒性远大于铅，重金属镉对环境的危害性最大，所以用脲酶活性来判断土壤重金属镉的污染程度是比较可行的方案。由于实验室的实验条件有限只研究了Pb、Cd对脲酶的影响，如果以后有条件可以研究点别的酶活性，找出一定的变化规律。
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关键词：麻疯树（Jatropha curcas L.）；盖度；土壤重金属；土壤酶活性；土壤理化性质；影响
中图分类号：S792.99；S714.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）03-0545-03
攀枝花市位于中国西部，是重要的矿业城市[1]，在矿山开采过程中，大量的矿石、尾矿沿江堆放，采矿废水和选矿废液的直接排放对河水和沿河土壤都造成了严重污染。土壤对重金属污染物的累积富集作用使得重金属污染日趋严重[2-5]。麻疯树（Jatropha curcas L.）作为生物燃料树种，种子榨油后油中的重金属含量是否超标应引起重视。
攀枝花市位于长江上游金沙江段，是麻疯树适宜的生长区域。这个区域的麻疯树群落结构和种群分布格局尚不清楚，不利于麻疯树生物多样性的保护和开发利用。麻疯树跨地区、跨生态系统引种对新的地区可能形成入侵的问题正逐渐受到重视。所以对攀枝花金沙江干热河谷麻疯树群落进行调查，获得麻疯树生物地理特点、有害特征以及生物学和生态学特征等方面的资料显得非常迫切。
本研究对攀枝花市仁和工业区、新盐边县麻疯树群落进行调查，对麻疯树所生长的土壤重金属含量进行测定并对土壤肥力、土壤酶活性的变化情况进行分析，以期为麻疯树野外环境调查提供参考。
1 研究地区与研究方法
1.1 研究地区概况
攀枝花市位于四川省西南部（101°15′-102°08′ E，26°05′-27°21′ N），地处川、滇南北构造带中段的安宁河构造带，东临攀西地区会理，南靠云南省永仁县，西临云南省华坪县和宁蒗县，北与凉山州地区德昌县、盐源县接壤，地形切割强烈，垂直分异显著。攀枝花市是川西南重要的矿业城市，被称为中国的钒钛之都。几十年的开发建设使该区经济发展迅速，但同时引发的环境问题也比较严重，如植被破坏、土壤和水体污染、生态环境恶化等，其中矿渣场对生态系统的破坏尤为严重[1，6-8]。
1.2 麻疯树群落盖度分布研究方法
2010年4月在攀枝花市新盐边县、仁和工业区进行采样，采样土壤有6种类型，表层（0～20 cm）取样，根据麻疯树的不同演替阶段、裸土区以及麻疯树和其他植物混生划分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型。Ⅰ型，麻疯树为优势种群，盖度约达90%；Ⅱ型，零星有当地植物生长，麻疯树盖度在60%左右；Ⅲ型，麻疯树与当地植物处于竞争生长，麻疯树盖度在10%～30%；Ⅳ型（CK），裸土区，几乎无任何植物成株生长；Ⅴ型，当地植物剑麻，盖度50%，没有麻疯树的生长；Ⅵ型，当地植物混合生长，单种植物各自的盖度均小于1%。将采集的土样风干、研磨、过筛，将过筛后的土样约500 g于室温保存，用于土壤各指标的测定。
1.3 测定指标及方法
1.3.1 土壤理化性质的测定 土壤基本化学性质测定均采用土壤农业化学分析法[9]，其中有机质采用电热板加热-K2Cr2O7容量法，水解性氮采用碱解扩散法，有效磷采用0.5 mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法，缓效钾采用1 mol/L HNO3煮沸浸提-火焰光度法，速效钾采用1 mol/L NH4OAc浸提-火焰光度法。
1.3.2 土壤酶活性的测定 脲酶活性采用靛酚蓝比色法测定，酸性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定，蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定[10]。
1.3.3 土壤重金属Pb、Cd含量测定 土壤样品Pb、Cd的全量经过浓HNO3∶HF∶HClO4（2∶1∶2）消化后用瑞利WFX-120A原子吸收分光光度计测定。
1.4 数据统计分析
上述试验均为3次重复，计算平均值，并采用SAS 8.2 软件和Excel进行统计分析和作图。
2 结果与分析
2.1 土壤理化性质、重金属含量与麻疯树群落盖度的关系
分别对6种不同群落形式的表层土壤pH、有机质、水解性氮、有效磷、缓效钾、速效钾和重金属铅、镉含量进行了比较，结果见表1。
土壤pH是土壤重要的化学指标，植被状况也对土壤pH产生一定的影响作用[11]。表1表明，pH在6种不同的群落形式上变化不同，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型的pH均高于裸土Ⅳ型，且随着麻疯树盖度的增加而增加，各类型间pH差异显著，Ⅴ型pH显著低于对照。土壤有机质是土壤的一个重要指标[12-15]，是植物营养的主要来源，但是在短时间内土壤有机质的变化不大。与裸土Ⅳ型相比，除了Ⅰ型外，其他类型的土壤表层有机质均显著高于裸土Ⅳ型，随麻疯树盖度的增加有机质含量呈现减少趋势。土壤氮素供应能力的高低主要取决于水解性氮的多少，土壤的矿化作用和植物对氮素的吸收直接影响着水解性氮的增减[16]，因而不同植被类型下水解性氮含量的增减情况有所差异。除Ⅲ型外，其他类型的土壤表层水解性氮均比裸土Ⅳ型减少，且Ⅰ型与裸土Ⅳ型差异显著。随麻疯树盖度的增加水解性氮含量逐渐减少。土壤磷素供应状况主要由土壤有效磷含量来表示。土壤pH、土壤有机质的含量以及土壤的分解状况和微生物的活动等因素共同影响土壤有效磷的含量[17-20]。与裸土Ⅳ型相比，除Ⅰ型外，其他类型的土壤有效磷均显著高于裸土Ⅳ型；随麻疯树盖度的增加有效磷含量先增加后减少。各种类型的群落与裸土Ⅳ型相比，除Ⅴ型外，其他类型的土壤缓效钾含量均高于裸土Ⅳ型；Ⅰ型、Ⅱ型的土壤速效钾含量均显著高于裸土Ⅳ型，其他类型的土壤速效钾含量均低于裸土Ⅴ型。所调查样地内土壤重金属Pb、Cd含量参照中华人民共和国国家标准中土壤环境质量标准（GB 15618—1995），Pb属于一级（Pb≤35 mg/kg），土壤Pb含量基本保持自然背景水平；有3个样地Cd含量高于国家允许安全限量（Cd>0.3 mg/kg）[21，22]。
2.2 土壤酶活性与麻疯树群落盖度的关系
土壤脲酶直接参与土壤中含氮有机化合物的转化[23]，其活性强度常用来表征土壤氮。表2表明，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型土壤表层脲酶活性分别比裸土Ⅳ型升高了78.9%、39.5%和89.5%，差异达显著水平。土壤中蔗糖酶直接参与土壤碳素循环[24]，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型土壤表层的蔗糖酶活性分别比裸土Ⅳ型升高了244.3%、115.9%和186.6%，差异达显著水平。酸性磷酸酶酶促作用能加速土壤有机磷的脱磷速度，从而提高磷的有效性和供应强度[25]，Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型土壤表层的酸性磷酸酶活性分别比裸土Ⅳ型升高了266.7%、125.0%和208.3%，差异达显著水平。随麻疯树盖度的增加，酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性呈现先升高后降低的趋势。
3 结论
有麻疯树分布的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅵ型土壤的缓效钾含量高于裸土Ⅳ型和单一剑麻Ⅴ型。pH在6种不同的群落形式上变化不同，与裸土Ⅳ型相比，随麻疯树盖度的增加pH逐渐上升趋于碱性，土壤有机质、水解性氮、有效磷含量总体呈现减少的趋势，速效钾、缓效钾含量有所提高。样地中土壤Pb含量基本保持自然背景水平；有3个样地Cd含量高于国家允许安全限量标准。
随着麻疯树在群落中的盖度增加，土壤酸性磷酸酶、脲酶和蔗糖酶活性呈现先升高后降低的趋势。土壤酶活性与植被盖度和生物量呈较高的相关性，土壤酶主要来自群落中植物的残体分解，结果表明土壤酶活性随麻疯树盖度的增加总体呈升高趋势，说明麻疯树使土壤环境条件向着有利于其自身生长的方向演变。麻疯树生长需要消耗大量的碳、氮、磷元素，从而导致了随麻疯树盖度的增加，土壤有机质、水解性氮、有效磷含量呈现逐渐减少的趋势；有麻疯树覆盖的土壤酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性均较裸土显著增加，从而有利于土壤中碳、氮、磷循环。
重金属的污染对土壤酶活性多表现为抑制作用，在Cd含量超标较严重的Ⅱ型样地中，酸性磷酸酶、蔗糖酶、脲酶活性受到明显抑制，其抑制机理可能是重金属与酶分子中的活性部位结合形成较稳定的络合物产生了与酶活底物的竞争性抑制作用，或可能由于重金属通过抑制土壤微生物的生长和繁殖，减少微生物体内酶的合成和分泌，最后导致土壤酶活性下降。
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关键词：土壤酶；重金属；作物；菌肥
中图分类号：S513 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.016
Effects of Applying Bacterial Manure on Enzymes of Copper Contaminated Soil with Planting Corn
GUO Zhuo-jie1，LI Tao1，YANG Ji-fei1，OH Kokyo2，CHENG Hong-yan1
（1. College of Resources and Environment ，Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi 030801，China；2.Center for Environmental Science in Saitama，914 Kamitanadare， kazo， Saitama 347-0115， Japan）
Abstract：With pot experiment，this paper studied the effects on 4 kinds of enzymes （urease， catalase， sucrase， phosphatase） of different varieties of corn （Jin dan56， Changyu16， Dazheng2） in copper contaminated soil in different dosage of bacterial manure conditions （0，50，100，200 g）.The results showed that for Dazheng 2 and Changyu 16， the dosage of 100 g bacterial manure in copper contaminated soil had apparent activation effect on catalase， urease， invertase and phosphatase；for Jindan 56， the dosage of 200 g bacterial manure in copper contaminated soil had apparent activation effect on catalase， urease， invertase and phosphatase；the effect of four kinds of enzyme in the copper contaminated soil， Dazheng 2 （Cu + J - 100） > Jin dan 56 （Cu + J - 200） > Changyu16 （Cu + J - 100）. The comprehensive consideration was that for Dazheng 2 corn， the amount of 100 g bacterial manure had the most obvious effect on catalase， urease， invertase and phosphatase activation， and the sizes of the four kinds of enzyme were 0.225 0，72.727 6， 0.858 0， 3.755 7 mg・g-1 respectively.
Key words： soil enzymes； heavy metals； crops； bacterial manure
近年来，随着土壤环境污染问题的日益严重，土壤重金属污染的防治问题已成为生态环境修复研究领域的重要内容之一，其中利用土壤酶活性来表征土壤重金属污染程度是其中一个尤为重要的方面 [1-3]。土壤酶是土壤的生物活性成分之一，它参与土壤中的众多代谢过程，是土壤生态系统代谢的重要动力，土壤中所进行的一切生物学和化学过程都要由酶的催化作用才能完成，在生态系统的物质和能量循环等过程中，土壤酶起到表征物质和能量转化强度的作用[4-5]。研究土壤酶活性的变化，将有助于了解土壤肥力状况及其演变[6-7]。而微生物菌肥（菌肥）对改善土壤营养结构，增强土壤肥力，促进作物生长，增强作物抗病能力等方面具有重要作用[8]。
目前关于重金属和土壤酶活性关系的研究已经很多，但多侧重于一种或几种重金属对土壤酶活性的影响或者是超富集作物在修复土壤重金属过程中对土壤酶的影响等方面，而菌肥和重金属复合条件下，玉米对铜污染土壤的修复研究还是很少报道的。故此，本研究通过盆栽试验，在重金属土壤中施加不同用量的菌肥，并且用不同品种的玉米进行修复，探讨其对土壤中4种土壤酶活性的影响，进而反映出菌肥对土壤酶的影响，并且选出对土壤酶影响较大的玉米品种和菌肥浓度配比，为铜污染土壤的修复与利用提供一定的科学依据。
1 材料和方法
1.1 试验区概况
试验区在山西农业大学资源环境学院实验站大棚。山西省太谷县位于晋中盆地东北部，属暖温带大陆性气候，年平均气温9.8 ℃，无霜期175 d，降雨量462.9 mm。供试土壤为石灰性褐土，pH值为 8.38，碱性土壤。其中碱解氮为129.41 mg・kg-1，速效磷为7.713 8 mg・kg-1，速效钾为16.6 mg・kg-1，有机质含量为10.9 g・kg-1，土壤交换量为23.92 cmol・kg-1，土壤铜含量为64.42 mg・kg-1。
1.2 供试作物和肥料
供试农作物：选择3个玉米品种，分别为晋单56号、长玉16号和大正2号。
供试肥料：以复合肥（N-P2O5-K2O，17-17-17，总养分≥51%）为基肥；微生物菌肥。
供试重金属铜的样品：CuSO4・5H2O （分析纯）。
1.3 试验方法
供试作物于2013年4月份种植，种植120 d，8月中旬收获。
试验共设4个处理，分别为：铜处理土壤+菌肥0 g（CK）；铜处理土壤+菌肥50 g（Cu+J-50）；铜处理土壤+菌肥100 g（Cu+J-100）；铜处理土壤+菌肥200 g（Cu+J-200）。在4种处理的土壤上种植3种不同品种的玉米，重复3次。每盆装10 kg的供试土壤，为确保试验土壤重金属铜达到统一的二级标准限制值100 mg・kg-1，每盆土壤所施用化学试剂CuSO4・5H2O（分析纯）为1.39 mg，随水施入土壤中，每盆施入复合肥5 g。
1.4 测定项目与方法
土壤脲酶：靛酚比色法[9]。
土壤过氧化氢酶的测定：容量法（用高锰酸钾滴定）[9]。
土壤蔗糖酶的测定：磷酸二氢钠比色法[9]。
土壤磷酸酶测定：磷酸苯二钠比色法[9]。
1.5 数据处理方法
土壤基本理化性状分析采用常规方法。所有数据均采用Excel和Dps软件进行分析。
2 结果与分析
2.1 不同品种玉米种植下菌肥对铜污染土壤脲酶活性的影响
土壤脲酶主要来源于植物和微生物，是决定土壤中氮转化的关键酶，其活性高低反映了各种生化过程的方向和强度。脲酶是一种酰胺酶，直接参与尿素形态转化，能促进有机质分子中肽键的水解，是尿素分解必不可少的一种酶[10-11]。由图1的方差分析可知：对于大正2号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）脲酶活性分别提高了69.7%，61.7%，15%，说明大正2号玉米加入菌肥100 g后显著激活了土壤中脲酶的活性，施入菌肥200 g抑制了土壤脲酶的活性；对于晋单56号玉米，（Cu+J-200）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-100）脲酶活性分别提高了61.3%，20.9%，3.7%，说明晋单56号玉米施入菌肥200 g显著激活了土壤中脲酶的活性；对于长玉16号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）脲酶活性分别提高了85.9%，42.1%，24.1%，说明长玉16号玉米施入菌肥100 g显著激活了土壤中脲酶的活性，施入菌肥200 g抑制了土壤脲酶的活性。而大正（Cu+J-100）比晋单（Cu+J-200）、长玉（Cu+J-100）分别提高了6.7%和9.7%，并且差异性显著。由以上数据分析得出：大正2号玉米，施入菌肥100 g对铜污染土壤中脲酶活性的激活效应最明显。
2.2 不同品种玉米种植下菌肥对铜污染土壤过氧化氢酶活性的影响
过氧化氢酶主要来源于细菌、真菌以及植物根系的分泌物，是参与土壤中物质和能量转化的一种氧化还原酶，具有分解土壤中对植物有害的过氧化氢的作用，其活性能反映土壤腐殖化强度大小和有机质积累程度[12-13]。过氧化氢酶活性以20 min内每克土壤消耗0.1 mol・L-1 KMnO4的毫升数表示[14]。由图2的方差分析可知：对于大正2号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）过氧化氢酶的活性分别提高了6%，3.4%，4.1%，说明大正2号玉米加入菌肥100 g显著激活了土壤中过氧化氢酶的活性，加入菌肥200 g抑制了土壤中过氧化氢酶的活性；对于晋单56号玉米，（Cu+J-200）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-100）过氧化氢酶的活性分别提高了5.9%，2.1%，1.9%，说明晋单56号玉米施入菌肥200 g显著激活了土壤中过氧化氢酶的活性；对于长玉16号玉米，（Cu+J+100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）过氧化氢酶的活性分别提高了4.6%，1.3%，2.9%，说明长玉16号玉米施入菌肥100 g显著激活了土壤中过氧化氢酶的活性，施入菌肥200 g抑制了土壤过氧化氢酶的活性。而大正2号玉米（Cu+J-100）比晋单56号玉米（Cu+J-200）、长玉16号玉米（Cu+J-100）分别提高了0.9%和1.8%，并且差异性显著。由以上数据分析得出：大正2号玉米，施入菌肥100 g对铜污染土壤中过氧化氢酶的活性激活效应最明显。
2.3 不同品种玉米种植下菌肥对铜污染土壤蔗糖酶活性的影响
蔗糖酶能催化多种低聚糖的水解，在土壤碳循环中起着重要的作用。它比其他酶类更能明显地反映土壤肥力水平和生物学活性强度以及各种农业措施对土壤熟化的影响[15]。蔗糖酶活性主要以24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫克数表示[16]。由图3的方差分析可知：对于大正2号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）蔗糖酶的活性分别提高了19.5%，6.9%，18.6%，说明大正2号玉米施入菌肥100 g显著激活了土壤中蔗糖酶的活性，施入菌肥200 g抑制了土壤蔗糖酶的活性；对于晋单56号玉米，（Cu+J-200）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-100）蔗糖酶的活性分别提高了15.5%，14.3%，11.8%，说明晋单56号玉米施入菌肥200 g显著激活了土壤中蔗糖酶的活性；对于长玉16号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）蔗糖酶的活性分别提高了14.7%，1.6%，3.6%，说明长玉16号玉米施入菌肥100 g显著激活了土壤中蔗糖酶的活性，施入菌肥200 g抑制了土壤蔗糖酶的活性。而大正（Cu+J-100）比晋单（Cu+J-200）、长玉（Cu+J-100）分别提高了3.46%和3.5%，并且差异性明显。由以上数据分析得出：大正2号玉米，施用菌肥100 g对铜污染土壤中蔗糖酶的活性激活效应最明显。
2.4 不同施肥条件下不同作物对铜污染土壤磷酸酶的影响
土壤磷酸酶是植物根系与微生物的分泌产物，直接影响土壤中有机磷的分解转化和生物有效性[17]。土壤磷酸酶活性以24 h后每克土壤酚的毫克数表示。由图4的方差分析可知：对于大正2号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）磷酸酶的活性分别提高了55.9%，29.4%，22.5%，说明大正2号玉米加入菌肥100 g显著激活了磷酸酶的活性，施入菌肥200 g抑制了土壤磷酸酶的活性；对于晋单56号玉米，（Cu+J-200）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-100）磷酸酶的活性分别提高了25.8%，12.6%，4.9%，说明晋单56号玉米施入菌肥200 g激活了土壤中磷酸酶的活性；对于长玉16号玉米，（Cu+J-100）比CK、（Cu+J-50）、（Cu+J-200）磷酸酶的活性分别提高了43.6%，6%，19.2%，说明长玉16号玉米施入菌肥100 g显著激活了土壤中磷酸酶的活性，施入菌肥200 g抑制土壤磷酸酶活性。而大正（Cu+J+100）比晋单（Cu+J+200）、长玉（Cu+J+100）分别提高了6.5%和8.5%，并且差异性明显。由以上数据分析得出：大正2号玉米，施用菌肥100 g对铜污染土壤磷酸酶的活性激活最明显。
3 讨 论
（1）对于大正2号玉米和长玉16号玉米，随着菌肥用量（0，50，100，200 g）逐渐增大，铜污染脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶大小先增大后减小，在菌肥用量为100 g时，4种酶活性最大，所以施入菌肥100 g对土壤中4种酶活性的激活效应最明显。
（2）对于晋单56号玉米，随着菌肥用量（0，50，100，200 g）逐渐增大，铜污染土壤中脲酶、过氧化氢酶、蔗糖酶、磷酸酶大小也逐渐增大，施入菌肥200 g对土壤中4种酶活性的激活效应最明显。
（3）对于土壤中脲酶活性大小，大正（Cu+J-100）>长玉（Cu+J-100）>晋单（Cu+J-200）。
（4）对于土壤中过氧化氢酶、蔗糖酶和磷酸酶活性大小，大正（Cu+J-100）>晋单（Cu+J-200）>长玉（Cu+J-100）。
4 结 论
综上所述，关于施用菌肥对玉米种植下铜污染土壤酶活性的影响，对4种土壤酶活性激活效应最明显的方式是施入100 g菌肥的大正2号玉米（Cu+J-100），其次是施入200 g菌肥的晋单56号玉米晋单（Cu+J-200），最后是施入100 g菌肥的长玉16号长玉（Cu+J-100）。
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1材料与方法
1.1土壤样品土壤采自我国西北地区某市的农田表层土壤，选取具有代表性的5个采样点，均采取0～20cm的样品，混合均匀后带回实验室。在洁净实验室内展开、风干，挑拣其中的植物、残根、石块及其他杂物。用木碾研磨过18目筛子。处理后的土样装入密封袋中密封保存，备用。土壤样品的主要理化性质见表1。
1.2实验设计选取转化酶、脲酶、碱性磷酸酶活性为指标，Cu、Zn、Pb和培养时间作为因素。实验因素和水平设计列于表2。外源污染物Cu、Zn、Pb复合作用对3种水解酶活性的影响选用5因素4水平的L16(45)型正交表(实验1)，在对各因素主效应分析之后，选取Cu、Zn、Pb三因素重新排定L8(27)正交表，用以考察三种污染物之间的交互作用对酶活性的影响(实验2)。指标水平参照土壤环境质量标准(GB15618-1995)，Cu、Zn、Pb分别以CuSO4•5H2O、Zn(CH3COO)2•3H2O和Pb(CH3COO)2•3H2O溶液形式加入，充分搅匀，加水使土壤湿度保持在土壤最大持水量的60%，置于培养箱内25℃黑暗恒温恒湿培养，每个处理做3份平行。
1.3测定方法土壤pH值：酸度计法；土壤有机质：重铬酸钾法；阳离子交换量：氯化钡法；重金属：电热板湿法消解-ICP-AES法；转化酶活性测定：3,5-二硝基水杨酸比色法，大小用24h，1g干土生成的葡萄糖毫克数表示；脲酶活性测定：苯酚钠—次氯酸钠比色法，大小以24h，1g干土的氨氮毫克数表示；碱性磷酸酶活性测定：磷酸苯二钠比色法，大小以24h，1g干土生成的酚毫克数表示（以上酶活性测定时均设3份平行，以及用水代替基质的对照样品和无土对照样品，以排除土壤和试剂中杂质的干扰）。数据使用Excel2010和Spss18.0进行分析。
2结果与分析
2.1Cu、Zn、Pb复合作用对土壤水解酶活性的影响通过观察法获得的平均值（表3）可知，转化酶活性、脲酶活性及碱性磷酸酶活性的最大值分别出现在实验3、实验1和实验1。对不同因素而言，分析每个水平上三种水解酶的平均值，转化酶活性、脲酶活性及碱性磷酸酶活性的最大值分别出现A1B1C4D3，A1B2C3D1及A1B1C1D3，并且A1B1C1D3与观察法的结果一致。方差分析结果显示（表4），在95%置信区间下，Cu对三种水解酶活性有显著影响，Zn和Pb对三种水解酶活性影响不显著。Cu对三种水解酶活性影响程度脲酶＞碱性磷酸酶＞转化酶。
2.2Cu、Zn、Pb的交互作用及各自主效应对土壤酶活性的影响表5是观察法的分析结果，转化酶、脲酶和碱性磷酸酶活性的最大值分别出现在实验6、实验4和实验1。分析每个水平水解酶活性总和的平均值，转化酶、脲酶和碱性磷酸酶活性的最高值是A2B2C2，A1B2C2及A1B1C2。A1B2C2与观察法结果一致，其他两个值与观察法结果相近。方差分析结果显示（表6），这些因素与转化酶活性关系不显著；Cu和Zn对脲酶活性有显著影响(p＜0.05)，Cu×Zn在p＜0.10时对脲酶活性有显著影响；其他因素，如Pb，Cu×Pb，Zn×Pb与脲酶活性之间无显著差异。然而，在95%置信区间下，除了Zn×Pb，其他因素与碱性磷酸酶活性之间均有明显差异。图1~3是添加到土壤样品中重金属浓度与土壤酶活性之间的关系图。从图1可以看出，样品的三种土壤酶活性都比参考样品(没有添加外源重金属)酶活性低。Cu对脲酶和碱性磷酸酶活性影响具有相同的规律，即随着Cu浓度的增加，土壤酶活性显著降低，并且在Cu浓度从100增加到400mg•kg-1时，碱性磷酸酶活性急剧下降。Cu浓度为400mg•kg-1时，脲酶活性和碱性磷酸酶活性分别是对照样品酶活性的49%和56%。当Cu浓度小于35mg•kg-1时，转化酶活性受到明显抑制作用，从35增加到100mg•kg-1时，酶活性轻微降低；当Cu浓度从100增加到400mg•kg-1时，酶活性显著降低。图2展示的是添加Zn以后三种水解酶活性表现出的不同变化规律。在Zn的浓度为500mg•kg-1时，转化酶活性和碱性磷酸酶活性均比对照样品酶活性降低，分别是对照样品酶活性的97%和91%，而脲酶活性有所增加，是对照样品的107%。首先，低浓度的Zn抑制转化酶活性，随后又表现出激活特性，当Zn浓度从300增加到500mg•kg-1时，酶活性有缓慢的增加；脲酶活性表现出不同的变化趋势，从最初显著增加到无明显变化。通常Zn对碱性磷酸酶活性表现出抑制作用。Zn对转化酶活性和脲酶活性的强化效应可能与它们是金属酶有关，并且该金属是Zn[3]。图3描述的是三种土壤水解酶活性对添加的外源Pb的响应。总体看，在Pb浓度为500mg•kg-1时，转化酶活性和脲酶活性均比对照样品升高，而碱性磷酸酶活性降低，是对照样品酶活性的87%。在低浓度时，Pb抑制转化酶活性，激活脲酶活性。在浓度从35增加到500mg•kg-1时，转化酶活性随Pb浓度增加而升高，而随后转化酶活性显著降低；脲酶活性随Pb浓度增加表现出不同的变化规律，当Pb浓度从35增加到350mg•kg-1时，酶活性降低，从350增加到500mg•kg-1时，酶活性显著增加；Pb则是碱性磷酸酶活性的抑制剂。不同的培养时间对酶活性也有一定的影响。在7到14天时，随培养时间的延长，转化酶活性和碱性磷酸酶活性表现出相同的变化趋势，即酶活性先升高，后降低。对脲酶活性而言，在第7天时有显著降低，随后随时间延长缓慢降低。水解酶活性与所添加的外源污染物的量之间的多元回归方程(式1~3)显示的信息与以上分析结果类似。从碱性磷酸酶活性与各污染因素添加量之间的多元回归方程可见，Cu、Zn、Pb的回归系数分别为-2.152、-0.451及-0.831，各因素对酶活性均表现为抑制作用，并且对酶活性影响的顺序是Cu＞Pb＞Zn。另外，Zn和Pb对脲酶活性表现出激活作用，而Zn对转化酶活性几乎没有影响，这些结论与以前的研究成果一致，同时与方差分析的结果相符。
3讨论
复合重金属对土壤酶活性的影响早有报道。本研究发现，与其他污染物相比，Cu可明显抑制土壤水解酶活性，并且抑制程度随金属Cu的含量增加而增大。Zn对转化酶活性和脲酶活性没有明显作用，不过Zn浓度为100mg•kg-1时可提高脲酶活性。然而，随着添加Zn量的增加碱性磷酸酶活性受到抑制。其实Cu、Zn和Pb对碱性磷酸酶活性均表现出抑制作用。重金属抑制土壤酶活性的机理有几种方式，包括使酶的催化活性基团失活、使蛋白质变性以及与那些形成酶-底物复合物所必需的金属离子竞争等[15]。Wang等发现土壤磷酸酶活性与金属Cu之间呈显著的负相关关系。Khan等指出重金属可与酶的巯基反应，形成金属-硫化物等同物进而抑制和/或使酶活性失活。抑制剂可通过改变酶的分子结构进而抑制脲酶活性。另外一些学者研究认为当重金属含量达到2000mg•kg-1时，脲酶活性可完全消失。Zeng等也指出，通常在特定的环境条件下，某些元素的含量超过某一范围时会对植被和微生物带来负面效应。另外，不同种类的酶对重金属含量变化带来的响应也不同。这可能取决于酶的灵敏度、酶结构上的抑制以及季节影响。同时，土壤因素，如pH、土壤有机质含量和粘土矿物成分也会有一定的影响。Wyszkowska等指出土壤酶活性对重金属影响的灵敏度排序是脱氢酶＞脲酶＞碱性磷酸酶。当重金属进入土壤，它们可以改变土壤pH值，一般是导致土壤酸化。Renella等认为在碱性土壤中，酸性磷酸酶活性更易受影响，而碱性磷酸酶活性在酸性土壤中更易受影响。除此之外，重金属抑制土壤酶活性的机理可能是钝化催化活性基团，与那些可以形成酶-底物复合物的重金属离子竞争，或者是使蛋白质成分失活。培养时间对三种土壤水解酶活性也表现出不同的影响。不过在第35天时所有的土壤酶活性均比第3天时低，这个结果与Naidu等的结论一致，即随着重金属在土壤中时间的延长，重金属的生物可利用性降低。因为重金属的生物利用率是土壤酶活性的主要来源，有其是对土壤微生物和植物。当三种重金属同时存在时，他们对酶活性影响的强度并不是他们单独存在时对酶活性影响程度之和，这可能是与同一个实验中的三种重金属之间发生了相互作用有关。在我们国家，土壤中重金属的主要来源有污水灌溉、工业废弃物堆放、城市固体垃圾堆放以及大气沉降等。刘树庆发现在保定市污水灌溉的农田中Zn、Cu、Pb和Cd的含量非常高，并且随着持续的污水灌溉金属含量一直在增加。另外，由于土壤存在多种重金属复合污染，其中种植的蔬菜也应经被污染。在该研究中，很少有人指出土壤中Cu、Zn、Pb的含量已接近污染的水平。有交互作用的实验结果显示，三种重金属复合效应对碱性磷酸酶活性影响最显著，尤其是Cu×Pb，其次是Cu×Zn。不过它们的这些影响都不及Cu单独存在时显著。Wyszkowska等曾有过类似的报道，他发现当Cu与其他重金属（如Zn、Pb、Cd和Cr）同时存在时，它对土壤酶活性的抑制作用比它单独存在时弱。对于此现象，其他解释是当两种重金属同时作用时(Cu×Zn,Cu×Pb)，Zn或Pb对土壤酶活性有保护作用。与Zn、Pb的自主效应比较，两者的复合效应降低了，这说明它们对碱性磷酸酶活性的影响具有拮抗作用。尽管Cu或Zn对转化酶活性有轻微影响并且没有统计显著性，不过它们的复合效应影响增加了，这说明在它们的二元系统中存在协同效应。不过，二元系统对碱性磷酸酶活性的抑制作用没有它们单独存在时显著，这可能是由于二者之间存在负的协同抑制效应。总之，添加的Cu、Zn、Pb对研究的三种土壤水解酶活性均呈现不同的影响。土壤酶活性被抑制或激活的程度随重金属种类及其浓度以及土壤酶种类的不同而有差异。一些学者报道土壤酶受到抑制或激活的程度顺序与众多因素有关，包括重金属种类、重金属浓度、分析的土壤酶种类；溶液中重金属与土壤酶官能团之间的反应；重金属之间的反应；土壤的理化性质，如pH、阳离子交换量、有机质含量，以及粘土矿物种类和含量等。这些过程可能导致土壤中不同重金属对土壤酶活性抑制或激活效应的不同。这些结果与其他的一些将土壤酶活性作为土壤重金属污染指示剂的研究结论一致。
4结论
关键词：黄瓜；轮作；大葱；土壤；连作障碍
中图分类号：S642.2 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.08.008
研究表明，蔬菜连作会导致生长受阻，抗病能力减弱，产品产量和品质下降[1-2]。连作土壤与轮作土壤相比，理化性质变劣[3]，酶活性降低[4]，微生物数目及种群多样性减少[5]。黄瓜是设施主栽蔬菜，连作障碍已成为制约其高产高效和可持续发展的重要因素。试验发现，大葱轮作可显著减轻黄瓜连作土壤障碍，促进生长，提高产量[6]，对此，前人从根区土壤的理化和生物学特性方面进行了探讨[6-8]。根际是植物与土壤进行物质和能量交换最剧烈的区域，根际土壤的理化和生物学特性与非根际土壤明显不同[9]。本试验以黄瓜连作土壤为对象，比较研究了大葱-黄瓜轮作和黄瓜-黄瓜连作两种栽培模式对后茬黄瓜根际土壤理化和生物学性状的影响，以期探讨大葱轮作减轻黄瓜连作障碍的机理，为制定合理栽培制度提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 材 料
供试土壤取自山东省泰安市岱岳区房村镇北滕村，为连续种植15年黄瓜的日光温室耕层土壤。土壤类型为棕壤，属砂壤土，土壤理化性状为pH 值6.19，EC值 825 μS·cm-1，碱解氮238.0 mg·kg-1，有效磷151.2 mg·kg-1，速效钾131.2mg·kg-1。
供试黄瓜（Cucumis sativus L.）品种‘新津11号’，大葱（Allium fistulosum L.）品种‘元藏大葱’。
1.2 方 法
1.2.1 试验设计 试验于2011年8月—2012年6月在山东农业大学园艺试验站日光温室内进行，设2个处理：大葱-黄瓜轮作（T），黄瓜-黄瓜连作（CK）。每处理30盆，随机排放。花盆直径30 cm，高25 cm，内装连作土壤10 kg。装盆前向土壤中均匀混入复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）10 g，生育期不再追肥。黄瓜、大葱分期播种育苗，2011年8月29日同时定植，黄瓜每盆1株，大葱每盆5株，12月20日拉秧。
后茬于2012年4月25日全部定植黄瓜，常规方法管理，6月20日拉秧。
分别于5月15日、5月25日、6月5日取样。每处理随机取5盆，利用雷娟利等[10]方法获得根际土样，混合均匀，研磨过2 mm筛，一部分于4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物分析；另一部分风干后过1 mm筛，用于土壤酶和理化指标分析。
1.2.2 测定方法
（1）土壤理化性状。pH值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁PHBJ-260便携式pH计测定，EC值按土水比1∶5（W/V）浸提，用雷磁DDB-303A便携式电导率仪测定；碱解氮采用碱解扩散法测定，有效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色法测定，速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定[11]。
（2）土壤微生物数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基培养；放线菌采用改良高氏1号培养基培养（每1 000 mL培养基中加入3%重铬酸钾3.3 mL）；真菌采用马丁氏培养基培养（每1 000 mL培养基中加入1%孟加拉红水溶液3.3 mL，1%链霉素3 mL）。微生物数量均采用系列稀释法计数[12]。
（3） 土壤酶活性。土壤脲酶采用苯酚-次氯酸钠比色法测定；磷酸酶采用磷酸苯二钠比色法测定；过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法测定[13]。
1.2.3 数据统计与分析 采用DPS软件对数据进行方差分析及最小显著差异性检验。
2 结果与分析
2.1 不同种植模式对黄瓜根际土壤EC值和pH值的影响
伴随生育期推进，黄瓜根际土壤EC值不断降低，生育初期轮作黄瓜的根际土壤EC值大于连作黄瓜，但定植40 d后，EC值开始低于连作黄瓜（图1）。连作和轮作黄瓜根际土壤pH值缓慢升高，轮作黄瓜上升幅度大于连作黄瓜，6月5日轮作黄瓜的根际土壤pH值高于连作黄瓜土壤。
2.2 不同种植模式对黄瓜根际土壤养分含量的影响
由图2可以看出，根际土中速效氮含量呈先升高后降低趋势，有效磷和速效钾含量则持续降低。生育初期，轮作黄瓜根际土壤中的速效氮、有效磷、速效钾含量高于连作土壤，尽管有效磷含量未达显著差异水平，说明前茬大葱吸收的养分较少。随着植株生长，轮作黄瓜根际土壤中有效磷含量迅速降低，以致低于连作土壤，速效氮与连作土壤无显著差异，速效钾含量却始终较高。
2.3 不同种植模式对黄瓜根际土壤酶活性的影响
脲酶是土壤中主要的水解酶之一，与土壤中尿素的水解密切相关，其酶促产物氨是植物氮源之一；磷酸酶可加速有机磷的脱磷速度，对土壤磷素的有效性具有重要作用，其活性是评价土壤磷素生物转化方向与强度的指标；过氧化氢酶促过氧化氢的分解，有利于防止它对生物体的毒害作用，其活性则可以反应土壤中氧化过程的强度[13]。根际土壤中3种酶活性均随黄瓜生长不断升高，但轮作黄瓜根际土壤酶活性始终高于连作土壤（图3），6月5日轮作土壤中脲酶、磷酸酶和过氧化氢酶活性分别是轮作土壤的1.24，1.11，1.27倍，说明轮作有利于提高后茬黄瓜根际土壤酶活性。
2.4 不同种植模式对黄瓜根际土壤微生物群落结构的影响
从图4可以看出，随着黄瓜的生长，根际土中细菌、真菌和放线菌数目均不断增加，其中，细菌在土壤微生物群落中占绝对优势。根际土壤中细菌、放线菌和真菌数初期差异不大，后期轮作黄瓜根际土壤中细菌、放线菌数目显著高于连作黄瓜，真菌数则显著低于连作黄瓜。轮作黄瓜根际土壤中真菌数占微生物总量的比例低于连作黄瓜，6月5日土壤真菌所占比例分别为0.28%和0.54%。
3 讨 论
设施连作障碍的一个重要原因是土壤酸化、次生盐渍化和养分失衡[14]。合理轮作可以降低土壤盐分积累，在一定程度上避免次生盐渍化的发生[15]。与连作相比，轮作黄瓜的根际土壤EC值降低速度较大，最后低于连作黄瓜根际土壤，可能与轮作植株生长势较强，吸收土壤中养分较多有关。王柳[16]发现，在不施肥或只施底肥情况下，黄瓜根区土壤pH值总体呈上升趋势。本试验中，伴随黄瓜生育，连作和轮作黄瓜根际土壤pH值均呈升高趋势，可能与只施用了底肥有关。
轮作黄瓜根际土壤中速效氮、有效磷和速效钾含量前期较高，说明前茬大葱吸收养分数量少于黄瓜。伴随生育进程，黄瓜根际土壤中养分含量快速降低，轮作黄瓜根际有效磷含量低于连作黄瓜，可能因为轮作黄瓜生长旺盛，对磷的吸收较多，同时磷在土壤中移动性较差[17]有关。土壤速效氮含量先升高后降低，可能由于根系生理活动使速效氮在根际发生了富集。钦绳武等[18] 对氮素在根际迁移规律的研究中发现，氮素在旱作根际土壤中会出现富集现象。
土壤酶直接参与土壤中物质的转化及养分的释放和固定过程， 与土壤肥力状况密切相关[19]。本试验中，大葱轮作模式下土壤酶活性明显高于黄瓜连作土壤。吴焕涛等[6]也得出相似的结论。土壤酶活性升高是轮作减轻连作障碍的原因之一。
土壤微生物群落结构的多样与稳定不仅可提高土壤微生态的稳定性，也可提高土壤的缓冲能力[20]。本研究结果表明，轮作黄瓜根际土壤中可培养细菌及放线菌数目均高于连作黄瓜，可培养真菌数目则低于连作黄瓜，与杨凤娟[8]、吴凤芝[21]研究结果一致，表明轮作可以改变土壤微生物群落结构，改善土壤的微生态环境。
本试验结果表明，大葱轮作后的黄瓜根际土壤理化及生物学性状得到明显改善，可作为防控设施黄瓜连作障碍的一种有效种植模式。
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关键词 烤烟；施肥处理；土壤酶活性；根系活力；影响
中图分类号 S572；S147.5 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）23-0018-03
Abstract Taking Yuyan 10 as experimental material，the effects of different fertilization treatments on the soil enzyme activities and root activity were studied by pot experiment.The results showed that compared with conventional fertilization，T1，T2，T3 and T4 treatments all improved the activity of soil catalase，soil invertase and soil urease in different degrees，and the treatment effect of T1 and T4 was better. The change trend of soil protease activity in different fertilization treatments was complicated，and there was no obvious regularity. The root activity of flue-cured tobacco in fast-growing period increased rapidly，and the effect of T1 treatment on root activity of flue-cured tobacco was the most significant.
Key words tobacco；fertilization treatments；soil enzyme activities；root activity；effect
近年恚我国的烤烟种植制度、施肥方式等已经发生了重大变化，尤其是化肥的不合理使用和有机肥料使用量减少，不仅造成了烟叶的产量和质量下降，同时也造成了土壤条件恶化、有机质含量下降、甚至环境污染，不利于我国烟区生产和烟区的可持续发展。土壤是农业生态系统的重要组成部分，具有贮存、释放、转化和调节营养物质在农业生态系统中运行的功能[1]。不同种植方式、秸秆还田、施用土壤改良剂、覆盖和施肥措施等均对植烟土壤关键酶活性和根系活力产生不同程度的影响[2-5]，而对芝麻饼肥、生物质炭与复合无机肥料配施对土壤酶活性的影响研究较少。本研究采用盆栽方式，研究不同施肥处理对植烟土壤关键酶活性及根系活力的影响，通过分析比较[6-9]，确定最佳的施肥组合，指导合理施肥，以提高烤烟生育期的土壤酶活性和根系活力，为烤烟生长、产量及品质形成以及烟区可持续发展提供依据。
1 材料与方法
1.1 试验地概况
本试验于2014年在河南科技大学开元校区农场进行，供试土壤为当地的黄潮土，质地中壤，耕层（0～20 cm）土壤有机质含量为10.80 g/kg、碱解氮含量为75.0 mg/kg、速效磷含量为9.21 mg/kg、速效钾含量为120.0 mg/kg。
1.2 供试材料
供试烤烟品种为豫烟10号。
供试肥料：商品化烟草专用无机复合肥（10-18-20，河南宜阳化肥厂生产）；商品化生物质炭（河南商丘三利新能源有限公司生产）；芝麻饼肥；小麦秸秆。
1.3 试验设计
采用盆栽试验，设置5个处理，分别为CK：常规施肥作对照，不施芝麻饼肥和生物质炭；处理T1：常规施肥+芝麻饼肥20.0 g/盆+生物质炭160.0 g/盆；处理T2：常规施肥+移栽后35 d秸秆覆盖还田（小麦秸秆，300.0 g/盆）；处理T3：常规施肥+芝麻饼肥20.0 g/盆；处理T4：常规施肥+生物质炭160.0 g/盆。烟苗于2014年5月16日移栽，每盆栽植1株，每个处理重复15盆。常规施肥：每盆施纯N量为3.5 g/盆，N∶P2O5∶K2O=1.0∶1.5∶3.0，磷、钾不足部分用单一磷肥和钾肥补充至所要求的氮、磷、钾施肥配比。
1.4 样品采集与指标测定
分别在烟苗移栽后30、45、60、75 d采集土壤0～20 cm耕层土样，每个处理取3个具有代表性的土壤样品，剔除样品中的石砾和植物残体等杂物，自然风干后研磨保存。在烟苗移栽后45 d和75 d拔取整个烟株，把根系冲洗干净后立即测定其根系活力[10-12]。
土壤关键酶测定主要包括过氧化氢酶、蔗糖酶、蛋白酶和脲酶[13-14]，其中用高锰酸钾滴定法测定土壤过氧化氢酶活性，过氧化氢酶活性以每1 g干土1 h内消耗的0.1 mol/L KMnO4体积数（mL）表示；土壤蔗糖酶活性采用3，5-二硝基水杨酸比色法测定，蔗糖酶活性以24 h后1 g土壤中葡萄糖的毫克数（mg）表示；土壤蛋白酶采用茚三酮比色法测定，蛋白酶活性以24 h后1 g土壤中氨基酸的毫克数（mg）表示；土壤脲酶采用苯酚钠-次氯酸钠比色法测定，土壤脲酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克数（mg）表示土壤脲酶活性。
根系活力测定采用TTC法，用TTC还原量表示脱氢酶活性并作为根系活力的指标[15-16]。
2 结果与分析
2.1 不同施肥处理对植烟土壤过氧化氢酶活性的影响
过氧化氢广泛存在于生物体和土壤中，对生物和土壤具有毒害作用，与此同时，在生物体和土壤中存在过氧化氢酶，能将过氧化氢分解为水和氧气，从而消除过氧化氢对植物的毒害作用。过氧化氢酶活性可以反应土壤腐殖质化的强度大小以及有机质转化的速度[17]。不同施肥处理条件下植烟土壤过氧化氢酶活性表现见图1。由图1可知，在生育期内植烟土壤过氧化氢酶活性的变化趋势较为平缓，并且各处理间的差异较小。烟苗移栽后30 d，各处理的过氧化氢酶活性均低于CK，且各处理间无显著差异；烟苗移栽后45 d，处理T3的酶活性最大，除处理T1外，其他处理的酶活性均高于CK，且各处理间没有显著性差异。烟苗移栽后60 d，处理T1、T2的活性低于CK，处理T3处理的酶活性高于CK，处理T4的酶活性显著高于CK，除处理T4外，各处理间无显著差异。烟苗移栽后75 d，除处理T2外，各处理的酶活性均高于CK，其中处理T4的酶活性最大。从土壤过氧化氢酶酶活性的动态变化来看，处理T3、T4的酶活性在生育期内一直增加，且处理T4增加的幅度最大，因此处理T4对提高过氧化氢酶活性的效果最佳，其次是处理T3。因此，处理T4对降低土壤中危害植物根系的过氧化氢的含量的效果最佳。
2.2 不同施肥处理对植烟土壤蔗糖酶活性的影响
土壤蔗糖酶与土壤中有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，其酶促作用产物直接关系到作物的生长，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越大[18]。不同施肥处理条件下植烟土壤蔗糖酶活性表现见图2。由图2可知，除了CK外，随着移栽天数的增加，不同施肥处理下的土壤蔗糖酶活性基本上呈现出先增大后减小再增大的趋势。除了CK外，各处理的土壤酶活性均在移栽后45 d时出现了高峰，并且不管在任何生育期，理T4的酶活性均高于CK，同时，除了在移栽后75 d时处理T4下的酶活性低于处理T3外，任何生育期处理T4的酶活性均高于其他几个处理。因此，处理T4施肥处理对植烟土壤蔗糖酶活性的提高效果最好。从标准误的角度分析，在移栽后30 d时，处理T2的酶活性最小，显著低于CK的酶活性；处理T1、T3的蔗糖酶活性大于CK，三者之间没有显著性差异；处理T4的酶活性最高，酶活性显著高于其他处理。烟苗移栽后45 d，各处理的酶活性均大于CK，其中处理T4的酶活性最大，且不同处理间差异性显著。烟苗移栽后60 d，处理T4的酶活性大于CK，而处理T1、T2和处理T3的酶活性均小于CK，酶活性呈现下降的趋势，各处理间蔗糖酶活性差异性不显著。烟苗移栽后75 d，各处理的酶活性均又升高，均显著大于CK的酶活性，处理T1、T2、T4之间的差异未达到显著水平。综合以上分析，处理T4（复合无机肥料和生物质炭配施）对提高植烟土壤蔗糖酶活性的效果最佳，能够改善植烟根际土壤肥力状况，为植烟生长创造最佳的生长环境。
2.3 不同施肥处理对植烟土壤蛋白酶活性的影响
土壤蛋白酶参与土壤中存在的氨基酸、蛋白质以及其他含蛋白质氨的有机化合物的转化，它们的水解产物是高等植物的氮源之一，因此蛋白酶活性的高低，会直接影响土壤对植物氮素的供应。不同施肥处理条件下植烟土壤蛋白酶活性表现见图3。由图3可知，不同施肥处理下的土壤蛋白酶活性变化趋势比较复杂，不同处理表现出不同的变化趋势。其中，CK和处理T3的酶活性表现为先减小后增大的趋势，处理T1的酶活性表现为先增大后减小的趋势，处理T2和T4的酶活性变化趋势最为复杂，都呈现先减小后增加再减小的趋势。从标准误的角度分析，烟苗移栽后30 d，除处理T3外，其他处理的酶活性均显著低于CK，处理T3和CK的酶活性无显著差异。烟苗移栽后45 d，除处理T4外，其他处理的土壤蛋白酶活性均高于CK，并且处理T3的酶活性最大，不同处理间的酶活性无显著差异。烟苗移栽后60 d，处理T1的酶活性最大，显著高于其他几个处理，而处理T2、T3、T4的酶活性均显著小于CK，处理T3的酶活性最小。烟苗移栽后75 d，不同处理下的酶活性均小于CK，且各处理间均无显著差异。
2.4 不同施肥处理对植烟土壤脲酶活性的影响
脲酶的催化作用极为专性，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤酶的活性，与微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关，常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素情况。不同施肥处理条件下植烟土壤脲酶活性表现见图4。由图4可知，随着移栽天数的增加，不同处理下的土壤脲酶活性的变化趋势较为复杂，其中，CK、处理T1、T4表现为先增大后减小的趋势，处理T2、T3表现为先减小后增加的趋势。从标准误的角度分析，在烟苗移栽后30 d，不同处理的脲酶活性均大于CK，并且处理T4的酶活性最高，处理T4的酶活性显著大于其他几个处理；处理T1和CK之间的酶活性大小无显著性差异，处理T4的酶活性均显著大于CK。烟苗移栽后45 d，不同处理的酶活性均大于CK，处理T1下的酶活性最大，其中处理T3和CK的酶活性无显著差异，处理T1、T4的酶活性大小均显著大于CK（P
2.5 不同施肥处理对烤烟根系活力的影响
根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的生长和营养状况及产量水平。不同施肥处理条件下烤烟根系活力表现见图5。由图5可知，在烟苗移栽后45～75 d，不同处理的根系活力均迅速增大，这是因为移栽后45～75 d是地上部分生长最快的时期，根系从土壤中吸取充足的水分和养分，才能保证烤烟的正常生长，从而协调烤烟植株地上部和地下部的生长。从标准误的角度分析，烟苗移栽后第45 d，各处理的根系活力均大于CK，且各处理间的根系活力大小无显著差异。烟苗移栽后第75天，除处理T1外，其他处理的根系活力均小于CK，各处理间根系活力无显著差异。总体来看，处理T1对增大植烟根系活力的效果最佳。
3 结论与讨论
不同施肥处理对植烟土壤关键酶活性和根系活力有重要影响。本研究结果表明，与不施芝麻饼肥和生物质炭的常规施肥对照相比，常规施肥+芝麻饼肥+生物质炭、常规施肥+秸秆覆盖还田、常规施肥+芝麻饼肥、常规施肥+生物质炭处理均不同程度地提高了生育期内植烟土壤蔗糖酶和土壤脲酶的活性，这与前人的研究相一致，其中以常规施肥+芝麻饼肥+生物质炭、常规施肥+生物质炭处理对提高土壤蔗糖酶和土壤脲酶活性的效果较好。
与常规施肥对照相比，4个处理对土壤过氧化氢酶活性影响不大，在烟苗移栽后30、45 d，4个处理的过氧化氢酶活性和对照相比均无显著差异；在烟苗移栽后60 d，常规施肥+生物质炭处理的土壤过氧化氢酶活性最大，而常规施肥+芝麻饼肥+生物质炭、常规施肥+秸秆覆盖还田和常规施肥+芝麻饼肥处理下的土壤过氧化氢酶活性均与常规施肥对照无显著差异；烟苗移栽后75 d，除了常规施肥+芝麻饼肥处理的酶活性显著小于常规施肥处理外，其他几个处理的酶活性均显著大于常规施肥对照（P
烤烟植株的地上部和地下部生长具有相关性，地上部正常生长发育和形成高品质的烟叶需要有强大的地下根系供给水分和矿质营养，而地下部根系的不断伸长和增粗也需要地上部叶片经过光合作用制造的有机物运输到根系。本试验结果表明，在烤烟处移栽后45～75 d时，此阶段是决定烟叶产量和质量的关键时期，因此在这一阶段中，根系活力迅速增加，以保证为地上部的生长提供充足的水分和矿质营养。分析可得，常规施肥+芝麻饼肥+生物质炭、常规施肥+秸秆覆盖还田、常规施肥+芝麻饼肥和常规施肥+生物质炭等4个处理的根系活力均与常规施肥对照无显著差异，但以常规施肥+芝麻饼肥+生物质炭处理对根系活力的提高效果最佳。
因此，在以后的烤烟生产中要注意合理扩充土壤碳库，以提高土壤酶活性和根系活力，为烤烟生长和特色优质烟叶形成奠定基础，促进烟区烤烟生产的可持续发展。
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