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1急性白血病
白血病是起源于造血干细胞的恶性克隆疾病，受累细胞（白血病细胞）增殖失控、分化障碍及凋亡受阻，蓄积于骨髓及其他造血组织中，从而抑制骨髓正常造血并浸润淋巴结、脾脏等器官，根据分化程度及自然病程可分为急性和慢性两大类。多数急性白血病患者在经过化疗诱导和巩固治疗后可达到完全缓解，但相当一部分患者在数月至数年内仍会复发。PML-RARa融合基因阳性的急性早幼粒细胞白血病（APL）除外，全反式维A酸（ATRA）的应用使患者预后得到巨大改善，Adès L等人指出APL患者使用ATRA+柔红霉素+阿糖胞苷强化治疗后2年无病生存率可达93%[2]。
NCCN指南根据细胞遗传学及分子生物学将急性髓系白血病（AML）分为低危、中危及高危组。低危组AML患者在大剂量阿糖胞苷巩固强化治疗后继续行维持化疗，其无病生存率（DFS）可达到50~60%，且治疗相关死亡率仅为8~10%[3]。EORTC/GIMEMA试验中指出接受allo-HSCT和auto-HSCT的两组中危AML患者的长期存活率相当，分别为62%、66%，而移植相关死亡率（TRM）分别为17%、6%[4]，allo-HSCT组的TRM明显高于auto-HSCT，故认为低危AML患者不宜选择行allo-HSCT治疗，可选择auto-HSCT或者维持化疗。
接受维持化疗的中危患者5年总生存率（OS）只有24%，而行allo-HSCT及auto-HSCT的患者5年DFS分别为48.5%、45.2%[4]，Farag等人[5]的研究中比较了auto-HSCT和大剂量阿糖胞苷两组的5年DFS，其分别为41%、45%，故allo-HSCT、auto-HSCT及大剂量阿糖胞苷化疗5年DFS相差不大，均可作为中危患者缓解后的一线治疗，临床上可根据中危AML患者综合考虑。
临床上认为急性淋巴细胞白血病患者不宜行auto-HSCT治疗。在MRC UKALLⅫ/ECOG E2993临床研究中，将无合适异基因供者的患者分为auto-HSCT及化疗组，前者的5年总生存率（37%）明显低于后者（46%），差异有统计学意义[6]。如果能找到合适的异基因供者，可首选allo-HSCT治疗。
2淋巴瘤
淋巴瘤（lymphoma）是源于淋巴结和淋巴组织的免疫系统恶性肿瘤，根据组织病理学改变分为霍奇金淋巴瘤（HL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）两类。霍奇金淋巴瘤是目前治疗效果较好、治愈率较高的恶性肿瘤，通过ABVD等方案化疗联合放疗，患者可良好获益。
常规化疗可使50~70%的NHL患者获得完全缓解，但仅有30%可长期无病生存，尤其是对于复发难治、高度恶性的NHL患者疗效欠佳。Philip的研究中将对化疗敏感的109例NHL复发患者分为auto-HSCT组和常规化疗组，auto-HSCT组的5年DFS及OS分别为46%、53%，而常规化疗组仅为12%、32%，明显低于auto-HSCT组，差异有统计学意义[7]。一项Ⅲ期前瞻性随机试验SWOG S9704中将IPI评分高的弥漫侵袭性NHL患者随机分为两组，分别为6周期CHOP方案化疗加auto-HSCT、8周期CHOP方案化疗，因相关研究显示加用利妥昔单抗（美罗华）能明显提高CD20+的B细胞淋巴瘤患者的OS及DFS，故两组中的相应患者采用RCHOP方案化疗，结果表明两组的2年DFS分别为69%、56%，差异有统计学意义[8]。综上所述，治疗失败的NHL患者及复发难治性NHL患者的标准治疗方案为大剂量化疗联合auto-HSCT，具有高危因素的CR1期患者的巩固强化治疗也可采用。
3多发性骨髓瘤
多发性骨髓瘤（MM）是一种骨髓中单克隆浆细胞大量增生，并分泌单克隆球蛋白，引起贫血、高钙血症、肾功能不全和骨病等临床表现的疾病。
NMSG94、MRCM Ⅶ等多项研究得出auto-HSCT治疗有效率明显高于化疗组，且无事件生存率及总生存期也明显优于化疗组, NCCN指南中已将auto-HSCT作为年轻MM患者的标准一线治疗方案[9]。但其生存曲线上不存在平台期，故学者们提出双次自体造血干细胞移植（tandem auto-HSCT）。荟萃分析显示tandem auto-HSCT可提高MM患者总的反应率及无事件生存期，并不能延长总生存期[10]。进一步分层分析，第1次移植未达到VGPR的患者可能于第2次移植后达到VGPR，而第1次已达到VGPR及以上的患者单次及双次移植疗效相当[11]。且因新药的临床应用，故认为仅第1次移植中未达到VGPR的患者推荐行tandem auto-HSCT。
Allo-HSCT可能是MM唯一治愈方法，因其有移植物抗骨髓瘤效应，但由于MM发病年龄偏大，重要脏器功能不全，且受供着来源及经济影响，故不作为一线治疗方案。如何能减低预处理强度、降低移植相关死亡率，同时能保留allo-HSCT的GVM效应，auto-HSCT序贯减低剂量allo-HSCT（auto-RIC-allo-HSCT）应运而生[12]。一项长期随访研究提示auto-RIC-allo-HSCT治疗组的24月非复发死亡率稍高于单纯auto-HSCT治疗组，但其5年无病生存率及总生存率明显高于auto-HSCT治疗组[13]，故对于有条件的MM患者来说，auto-RIC-allo-HSCT治疗是一个合适的选择，有治愈MM的可能，值的进一步探索及研究。
综上所述，造血干细胞移植在血液系统恶性肿瘤中的治疗效果是肯定的，在某些疾病上已获得非常好的疗效。但如何提高患者移植前的缓解率、减少移植相关并发症、延长无病生存时间及总生存期等问题还需广大学者进一步探索和研究。
参考文献：
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[关键词] 骨组织工程；脐带；间充质干细胞
[中图分类号] R329 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）10（c）-0195-02
骨折及骨科疾病是临床中较为常见的病症，为患者带来了一定身体痛苦与经济负担。目前临床中针对骨折与骨科疾病的治疗，主要采用自体移植、人工植入及异体移植等，但上述方式均存在一定缺陷。MSCs具强大的多向分化功能，能够诱导分化成骨细胞，帮助提升骨折或骨科疾病的治疗效果。在此背景下，对骨组织工程中脐带间充质干细胞的应用进展进行分析具一定现实意义。
1 MSCs的分离与培养
1.1 MSCs的分离
吉林大学生物医学工程学院的杨晨[1]对MSCs的分离进行了研究，首先在手术室收集得到足月分娩的、健康的、新鲜的胎儿脐带，将其放于融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中，在实验室内对脐带进行间充质干细胞分离。其次，将脐带取出，浸泡于酒精内约5 min，后以碘酒进行充分擦拭消毒，置于氯化钠溶液下反复清洗，直至血块完全冲掉。将脐带剪至2 cm/段的大小，以镊子固定住脐带边缘，用剪刀小心剔除脐带外膜，将内含的华氏胶组织分离出来。取胶完成后接着剔除脐带内的血管，再次以氯化钠溶液冲洗，或直接在融入了浓度为0.1%双抗的氯化钠溶液中进行，以保证操作的无菌性。
1.2 MSCs的培养
武汉大学中南医院的胡培[2]等人对MSCs的分离、培养进行了研究，其MSCs分离操作与杨晨基本相同，华氏胶组织成功分离后，将其放入α-MEM培养液（内涵100 U/mL链霉素与青霉素、10%胎牛血清）中，在CO2浓度为5%、箱内温度为37℃的培养箱内进行培养，根据细胞生长情况，以0.25%胰蛋白酶进行传代培养。北京协和医学院的李铎[3]选择将切成管状的脐带继续切片，再将片状脐带组织切割致2～3 mm3，利用吸管逐一将碎状脐带组织植入T75培养瓶中，培养瓶已预先由D/F12培养基（内含有浓度为20%的FBS）包被完成，植入密度为每瓶20～25块碎状脐带组织；再将培养瓶置于温度为37℃，CO2浓度为5%的温箱中，定时向箱内补充培养基（1 mL/d），每隔3 d全量换液。
哈尔滨第五医院手外科分院的聂广辰[4]等人对脐带间充质干细胞生长曲线的绘制进行了研究，在细胞传代培养至第3代时将其分别种植于6孔板的其中4孔中持续培养8 d，按MTT法对细胞的增值情况进行测定，当细胞增值密度饱和，细胞进入平顶期时停测。卓峰等人[5]在细胞增殖特定于曲线绘制的研究中提出，现阶段培养MSCs普遍采用的方法包括酶消化法与培养法，对MSCs细胞进行初代培养，该过程消耗约2 w，当细胞融合率致80%时开始传代培养，在细胞种植2～4 d时增殖趋势最盛，传至第15代时增殖速度开始减慢，至20代时增殖基本结束。早期的细胞增殖的潜伏期在植入后的36 h内，之后开始了成对增长（5～6 d），增殖密度达到饱和后进入到平顶期，综上可知细胞增殖曲线呈“S”型。
2 MSCs的特征
2.1 细胞形态与生长特征
第二军医大学的胡凯猛[6]在显微镜下对MSCs的形态进行观察，按贴块法获取初代细胞后对其进行种植，4～5 d后即可在贴块下方观察到沿瓶底生长的hUMSCs，种植7 d后能够观察到细胞数量不断增多，主要呈小梭形及小三角形，继续培养细胞渐成集落状生长，且生长状态较为均衡，边界清晰，伴有生长晕。酶消化法培养下初代细胞生长速度较培养法快，通常2～3 d后即在瓶底出现细胞，7 d后由小梭形及小三角形变为多角形、纺锤形，且生长迅速，集落生长呈紧靠型。14～15 d后达到约85%的融合。MSCs胞浆较少，小梭形的形态较为显著，细胞核周的颗粒物质较少，消化传代完成后细胞解除集落样生长，且分布均匀。
2.2 细胞免疫学特征
吕鹏飞等人[7]在关于细胞免疫学特征的研究中提出，MSCs的免疫学优势显著，主要表现在其可以脱离免疫抑制作用而冲破MHC屏障，将细胞植入远交动物体内。在UCMSC的免疫学特征分析中，证实其对人外周血单核细胞、鼠脾细胞及纯化T细胞等免疫细胞具有抑制作用，从而减缓其增殖速度。毛希宏[8]的相关研究证明MSCs表面的抗原存在非专一性，主要包括细胞因子与生长因子受体类、粘附分子类、整和素家族成员类与其他分子类等四大类，实验结果表明UCMSCs中，CD29、CD73、CD44、CD13、CD105的阳性率超过90%，而CD134、CD45、CD11b则为阴性，在23代内的传代培养中，各类细胞因子无明显差异，证明UCMSCs在经过多代培养之后免疫学性质较为稳定。
2.3 细胞的诱导分化特征
hUCMSC的诱导分化能力较强，能够实现多向分化，包括内胚层、中胚层与外胚层。在张亚斌等人[9]的细胞诱导分化体内研究中，证实hUCMSC能够分化成为内皮细胞、心肌细胞、骨骼细胞、多巴胺能神经元细胞、神经细胞等，而在细胞诱导分化体外研究中，还发现hUCMSC可分化为成骨细胞、肝细胞、脂肪细胞、胰岛样细胞、生殖细胞、平滑肌细胞等，在研究hUCMSC分化成为成骨细胞时，发现在诱导过程中hUCMSC的ALP活性提升，且钙结节与钙沉积现象明显，证明其具成骨细胞的诱导潜能。上述研究结果表明，hUCMSC诱导分化功能强大，在临床中的应用价值与应用范围明显优于造血干细胞。
3 讨论
骨组织工程是近年来临床新兴的学科，其中胚胎干细胞作为骨组织工程研究的热点与重点，受到了临床医学界的广泛关注。通过上述研究可知，MSCs分化潜能较高，在软骨、成骨、韧带、肌腱、肌肉、神经、心肌、肝等组织中均具诱导分化潜能，临床应用前景广阔。李素萍等人[10]相关研究发现，在标准的细胞培养环境下，MSCs能够沿培养瓶进行增值，可以表达CD44、CD105及CD90，但不能表达HLA-DR、CD34及CD45，在体外培养时表现出成骨细胞的诱导分化潜能。
在此背景下通过改进现有MSCs诱导分化为成骨或软成骨细胞的培养方式，或在已知干细胞的基础上找寻新型干细胞，以提升胚胎细胞在骨组织工程研究中的合适度，成为目前国内外相关研究的探索目标。在现代生物科技快速发展的时代背景下，学者们一定可以寻找到理想的培养途径或干细胞类型，不断推动骨组织工程的发展前进。
[参考文献]
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[9] 张亚斌，解莉楠.人脐带间充质干细胞研究进展及应用前景[J].生物技术通讯，2013，24（3）：437-438.
骨髓间充质干细胞(bonemarrowmesenchymalstemcell,MSC)是存在于骨髓中的具有高度自我更新能力和多相分化潜能的成体干细胞,又称骨髓基质干细胞、间充质祖细胞。
1MSC的生物学特性
MSC具有高度自我更新能力和多相分化潜能,体外培养的MSC有快速黏附和克隆能力,可以在体外培养20~25代而没有形态、生长曲线和免疫表型的明显改变,且保持着细胞的染色体核型和端粒活性。MSC在体外诱导培养条件下,能够向不同谱系的细胞分化,如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、星形胶质细胞等[1]。
2MSC的免疫学特性
由于MSC不表达主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ分子、CD40、CD80、CD86
等共刺激分子,不表达或极低水平表达MHCⅠ分子,MSC不易被宿主T细胞识别,并能逃脱宿主免疫系统的排斥,因此认为MSC具有低免疫原性。
3MSC在临床医学中的应用
3.1MSCs用于心血管疾病的治疗机制当MSCs移植到损伤的心肌局部后,MSCs能分化为心肌细胞系,表达心肌特异性蛋白质,包括:αactinin,troponinT,tropomyosin,myosinheavychainMHC,phospholamban,和其他的心肌特异性蛋白质。更重要的是,在MSCs移植后的心肌组织中检测到了connexin43,该种蛋白质反映的是细胞之间的连接以及细胞与细胞之间的电偶联。
3.1.1MSCs促进缺血或梗死部位血管再生由于新生血管的生成,增加了梗死部位心肌的血供,通过挽救冬眠的心肌、减少肥大的心肌细胞的凋亡、帮助恢复损伤的基质来减少心室的扩张和改善心功能。
3.1.2MSCs向收缩性心肌细胞分化细胞移植的最初目标是所移植的细胞能取代死亡的可收缩的心肌细胞从而恢复心功能。
3.2MSCs移植治疗脑梗死的可能机制
3.2.1刺激内源性神经干细胞和神经祖细胞的增殖分化在正常情况下,中枢神经系统内存在尚未激活的神经元。脑缺血时,BMSCs可激活这部分神经元,从而促进神经功能恢复。
3.2.2MSCs自身分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞MSCs具有多潜能干细胞特性,在特定条件下可以打破胚层起源的限制向外胚层神经元细胞和内胚层肝卵圆细胞分化,发展为成熟神经细胞,替代损伤细胞,重建神经环路,从而达到恢复神经功能的目的。大量体内外试验研究显示MSCs可分化为神经样细胞和神经胶质细胞。Woodbury等也证实大鼠及人的MSCs经体外传代后,在特定条件下可分化为神经元。
3.2.3促进血管生成,改善局部血液供应MSCs静脉移植入脑缺血大鼠模型后,发现大鼠缺血周边区域有新生的血管生成,同时相应部位血管内皮生长因子(VEGF)的分泌和VEGF受体22的表达增加,提示MSCs有可能通过促进新生血管生成实现来改善神经功能的作用。
3.3骨髓干细胞介导肾脏再生研究
3.3.1由MSC分化形成2004年Marina等研究了MSC对急性肾衰竭时肾实质细胞的修复及肾功能恢复的意义。他们利用抗癌药物顺铂建立肾损伤模型,将转保护性顺铂治疗基因雄性小鼠骨髓间充质干细胞注射由顺铂引起肾功能缺陷和严重肾小管损伤的雌性小鼠。含有Y染色体的细胞定位在肾小管上皮层并表达Lensculinaris凝血素结合位点,证明移植MSC可以修复受损肾脏并可分化为肾小管上皮细胞,从而恢复肾脏的组织结构和功能。顺铂诱导肾小管损伤可以使MSC显著增强促进肾小管上皮细胞增生的能力。
皮肤细胞“变身”为血细胞
“血荒”是世界性临床医学中存在的一个问题，医院用血频频告急，不少需要输血的病人不得不苦苦等待，错失了最佳治疗时机。最近，一项医学研究的新成果，为这些人带来了希望。加拿大研究人员宣称，他们绕过诱导多功能干细胞，可以直接将人体的皮肤细胞变为血液细胞，这种新方法不仅对于理解细胞分化及再生医学研究有重要意义，而且它标志了生命科学的一个重要里程碑。3年前，美国人和日本人分别绕开胚胎，直接将普通皮肤细胞转化为干细胞，已经引起了轰动。如今加拿大人又绕开了干细胞，直接将皮肤细胞转化为血液细胞。由于这种细胞本身早已发育成熟，它不再需要花时间进行培养，因此这种方法更快捷、更实用。这样就有望彻底解决病人用血问题，其意义将更大。例如，医生们可以从白血病患者的身上提取皮肤细胞，直接将它转变成熟、健康的血细胞，输入患者自己的体内，不用再担心有任何排斥反应或发生感染等并发症；有RH、MNSSU、DUFFY等稀有血型的人也可以事先制造出一些“稀有血液”，以备日后自己或他人急用；那些因为手术或者贫血治疗等需要血液的患者也能够使用自己的皮肤供血。此外，这一研究成果还有一个重要的“潜在意义”，它或许意味着科学家可以利用皮肤细胞制造出其他成熟细胞，例如脑细胞等。如此一来，治疗老年痴呆症和帕金森综合症便有了新希望。 研究人员是如何使皮肤细胞变身的呢?简单的过程如下：他们从各年龄段成年人以及新生婴儿的皮肤上收集了皮肤纤维细胞，并让这些纤维细胞感染一种植入了OCT4基因的病毒，这种基因是一种干细胞全能性基因，可将纤维细胞转化为干细胞，再将这些细胞置于含有多种细胞因子的特殊溶液中进行培养。结果发现，无论接受试验者的年龄多大，他们的皮肤细胞都可以被“改造”成血细胞，由此生成的血液祖细胞产生了血液所具有的3种细胞――白细胞、红细胞以及血小板，而且都能够发挥其应有的功能。
皮肤细胞变为神经细胞
2010年初，美国斯坦福大学医学院研究人员宣布，他们在实验中绕过诱导多功能干细胞这一步骤，首次直接将实验鼠皮肤细胞转化为神经细胞。这项研究的意义是重大的，在医学界是一个“巨大的飞跃”，它为研究脑细胞功能紊乱提供了新方法，科学家可能仅在实验室托盘中就能研究帕金森氏症、阿尔茨海默氏症或遗传性精神病等病症，找出引起这些疾病的原因，直接用患者自己的皮肤细胞来治疗这些疑难杂症。
皮肤细胞的“变身”是利用了一种名叫“慢病毒”的基因运输工具来完成的，这种“慢病毒”不像真正的病毒，对人体不会产生不利的影响，但它携带和转化基因的能力却很强。研究人员首先选择了19个与细胞重组或神经发展有关的基因作为候选基因，通过慢病毒将这些基因植入到实验鼠的皮肤细胞中。32天后，其中一些皮肤细胞开始向神经细胞转化。研究人员根据实验结果，从19个候选基因中筛选出3个基因，再次利用慢病毒将它们转入到小鼠尾部的皮肤细胞。一周内，约20％的小鼠皮肤细胞转化成了神经细胞，这些神经细胞不但有神经蛋白，而且可与实验中的其他神经细胞形成突触联系。
【关键词】流式细胞术；临床；进展
流式细胞术(flowcytometry,FCM)是20世纪70年展起来的对单细胞定量分析的一种新技术。它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术,具有极高的检测速度与统计精确性,而且从单一细胞可以测得多个参数,为生物医学与临床检验提供了全新视角和强有力手段[1]。目前,随着单克隆抗体技术的发展,流式细胞仪检测技术已经广泛使用在基础研究和临床实践的各个方面,发挥着重要作用。本文就其在临床上的应用综述如下。
1 流式细胞术在免疫学中的应用
FCM可以进行淋巴细胞亚群分析,可同时检测出一种或几种淋巴细胞表面亚群分析,将不同的淋巴细胞亚群区分开来,并计算出它们相互间的比例。通过对患者淋巴细胞各亚群数量的测定了解淋巴细胞的分化功能,鉴别新的淋巴细胞亚群。更重要的是通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群或某些细胞表面标志的存在、缺乏、过度表达等,对一些疾病,如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等诊断、治疗、免疫功能重建和器官移植监测等有重要的临床意义。如HIV主要侵袭CD4+T细胞而导致CD4淋巴细胞减少,CD4/CD8淋巴细胞比值下降,为艾滋病的诊断和治疗提供依据[2]。在其它免疫功能性疾病的诊治方面如系统性红斑狼疮(SLE)患者的淋巴细胞变化可反映该病的活动情况和器官侵犯程度,伴有严重肾脏损害的SLE患者可出现低CD4+、高CD8+的现象[3]。此外,FCM可以用来进行组织相容性抗原(HLA)群体分析;HLA-B27抗原阳性与强直性脊柱炎等一系列关节病有着不同程度的正相关。FCM应用HLA-B27特异性单抗检测抗原，其敏感性较传统的微量细胞毒性实验大大提高,同时多参数的荧光测定使我们能够在特定的细胞亚群中分析HLA-B27[4-5],还可以利用FCM进行移植配型移植后免疫状态监测。
2 流式细胞术在血液学中的应用
血液系统肿瘤的诊断和治疗 FCM通过对外周血细胞或骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析，对白血病、淋巴瘤等各种血液病的诊断、预后判断和治疗起着举足轻重的作用。FCM采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料测定一个细胞的多种参数，以正确地判断出该细胞的属性。各种血细胞系统都具有其独特的抗原，当形态学检查难以区别时，免疫表型参数对各种急性白血病、淋巴瘤的诊断和鉴别诊断有决定性作用，其诊断的准确性可达到90%左右[5]。微小残留病变(MRD)是白血病复发的主要根源,FCM能在患者缓解期检测是否有残留病变细胞，及早发现后采取措施避免复发。而且测定 DNA倍体和进行细胞周期分析对指导白血病化疗也有一定作用，不同的白血病患者或同一患者在不 同病期白血病细胞增殖状况不同，定期了解细胞增殖情况采取相应药物可以提高疗效。急性白血病的多耐药基因(MDR)也常用FCM检测，FCM特有的敏感性和特异性，用于检测二氨基苯茚酮 mRNA的表达产物 P糖蛋白(Pgp)及其活性(作为药物的排出泵，降低细胞内药物浓度)，可以更直接的反映耐药程度。阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是一种造血干细胞克隆病,细胞 CD55、CD59抗原表达减低是该病的一个特点。FCM采用荧光标记的单克隆抗体对血细胞 CD59的表达做定量分析，可以协助临床做出诊断并判断疾病的严重程度。网织红细胞计数是反映骨髓造血功能的重要指标。FCM通过某些荧光染料(吖啶橙等)与红细胞中 RNA结合，定量测定网织红细胞中 RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比。有报道认为[6]FCM比目测法的精确度更高。此外，FCM还可以测量出网织红细胞的成熟度，对红细胞增殖能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放、化疗对骨髓的抑制状况等提供了依据。造血干/祖细胞计数造血干/祖细胞具有自我复制和多向分化潜能，是各种血细胞和免疫细胞的始祖。造血干/祖细胞计数对造血干细胞移植意义重大。CD34抗原是早期造血干/祖细胞的表面标志，应用 FCM分析、计数 CD34 细胞已成为造血干/祖细胞移植、造血重建的重要指标。由于血小板的活化程度可由血小板膜糖蛋白的表达水平的高低来判断,FCM测定血小板膜糖蛋白的表达情况可以诊断血小板膜糖蛋白异常所致疾病,这类疾病很少见但病因明确,主要是GpⅡb/Ⅲa或GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ缺陷所致。患者血小板膜GpⅡb/Ⅲa的缺乏,导致血小板聚集功能明显低下,这就是常染色体隐性遗传病-血小板无力症。而巨血小板综合征是由于GpⅠb/Ⅸ/Ⅴ复合物数量或质量的缺陷导致的遗传性出血性疾病。FCM还可以通过单抗免疫荧光标记血小板膜糖蛋白监测血小板功能及活化情况,评价活化血小板程度在血栓性疾病和血栓前状态发生发展中的作用,有利于血栓栓塞性疾病的诊断和治疗,此外血小板活化时细胞内的钙离子浓度是活化血小板监测的一项非免疫性指标,免疫性血小板减少性紫癜患者血浆中可产生血小板自身抗体,结合在血小板表面,称为血小板相关抗体,检测血小板表面或血清中的相关抗体,可用于该病的诊断及治疗监测[7]。
3 流式细胞术在肿瘤学中的应用
FCM在肿瘤学中的应用主要是利用DNA含量测定进行包括癌前病变及早期癌变的检出、化疗指导以及预后评估等工作,FCM可精确定量DNA含量,能对癌前病变的性质和发展趋势做出判断,有助于癌变的早期诊断[6]。首先需要把实体瘤组织解聚、分散制备成单细胞悬液,用荧光染料(碘化吡啶P1)染色后对细胞的DNA含量进行分析,将不易区分的群体细胞分成三个亚群(G期、S期、G2期),DNA含量直接代表细胞的倍体状态,非倍体细胞与肿瘤恶性程度有关。DNA非整倍体细胞峰存在可为肿瘤诊断提供有力依据[6]。肿瘤细胞DNA倍体分析对患者预后的判断亦有重要作用。异倍体肿瘤恶性病变的复发率、转移率及死亡率均较高,而二倍体及近二倍体肿瘤的预后则较好。FCM不仅可以对恶性肿瘤DNA含量进行分析,还可根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化去评估疗效,了解细胞动力学变化,对肿瘤化疗具有重要的意义。临床医师可以根据细胞周期各时相的分布情况,依据化疗药物对细胞动力学的干扰理论,设计最佳治疗方案。从DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化,及时选用有效的药物对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果。
4 流式细胞术在细胞凋亡和多药耐药基因中的应用
细胞凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞死亡的过程,凋亡典型的形态特征是核染色质固缩并分离,细胞质浓缩,细胞膜和核膜皱曲,核断裂形成片断,最后形成数量不等的凋亡小体。FCM可以进行DNA含量分析,通过二倍体细胞G0/G1期峰前的亚二倍体峰来确定。在凋亡早期,一些与膜通透性改变及凋亡有关的蛋白在细胞膜表面有特定表达。通过FCM结合单克隆抗体可以检测表达这些蛋白的细胞,从而确定细胞的凋亡情况。多重耐药性(multidrugresistance,MDR)是由多药耐药基因编码的P糖蛋白(P-gp)亲脂化合物,包括多种抗癌药物和荧光染料的跨膜性排出泵。从人淋巴细胞排除荧光染料与细胞内P-gp的含量直接相关。当淋巴细胞出现MDR阳性细胞时,患者对化疗药物开始出现耐药性,需要考虑其它治疗方式。多药耐药是肿瘤患者化疗失败的主要原因,FCM对多药耐药基因(如P170)和凋亡抑制基因及凋亡活化基因表达的测定,可为临床治疗效果分析提供有力依据[8]。
5 流式细胞术在器官移植中的应用
FCM在器官移植中占有重要地位,可被用来判断供者与受者之间是否合适,用来鉴别和定型同种异体反应抗体[6]。通过供者白细胞和受者的血清共同孵育,如果受者血清中存在针对供者的循环抗体,就会同供者的淋巴细胞结合,再加入荧光素标记的二抗来显示这种结合,此方法能在移植手术前发现高风险的受体。移植后免疫表型的监测也很重要。FCM可用于检测移植后血液或移植内免疫成分的变化,以预防移植后免疫
排斥反应,细胞免疫抑制治疗效果和移植存活情况,可敏感地预测排斥反应的发生,为临床治疗提供有效依据。
6 流式细胞术在临床细菌学中的应用
流式细胞术在临床细菌学中的应用具有快捷、灵敏,能同时进行多参数分析等优点,可广泛用于细菌、病原体、毒素和血清抗体及药敏试验。免疫荧光检测方法中的流式微球分析(CBA)是FCM的一个新应用。这种方法也可用于真菌、寄生虫、病毒以及这些病原体的混合感染的检测。近年来,FCM与荧光染料的联合运用可判断细菌的活力和功能状态,由于速度快,该方法已被建议作为临床实验室的常规药敏试验。FCM药敏检测方法较多,通过测量加入药物孵育后的散射光的DNA含量来判断抗生素对细菌的敏感性。该法现被认为是FCM在该领域应用的经典方法[6]。
7 FCM在细胞生物学中的应用
在细胞周期内,DNA含量随时相发生周期性的变化,通过荧光探针对细胞进行相对DNA含量测定,可分析细胞周期各时相细胞的百分比,周期动力学参数以及DNA异倍体。可利用与钙离子特异结合的荧光染料和激发光谱或发射光谱是pH值依赖荧光染料进行细胞内钙离子浓度测定和细胞内pH值测定[9]。
8 流式细胞术在优生遗传领域中的应用
流式细胞术可使含量极微的胎儿有核红细胞得到富集,因为有核红细胞含有胎儿的全部基因,并具有不影响多胎妊娠等优点,结合FISH,PCR等技术,使之具有应用于无创性产前诊断的广阔前景[10]。
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创伤是医学中最古老又最新颖的课题。说它古老，因为自有人类出现起就有了创伤；说它新颖，是因为近几十年来，随着城市建设和交通的高速发展，以及汽车数量的急剧增加，创伤呈不断增多之势。现全球每年因创伤致死者数百万人，受伤数千万人以上，故有人将创伤称之为“发达社会疾病”，或称“现代文明的孪生兄弟”。在美国，创伤是第4位死因，而20世纪初仅为第7位死因；在我国，创伤已成为城市中的第5位死因，农村中为第4位死因。此外，创伤多发生在青壮年，对社会劳动力的影响很大，其潜在寿命丧失年数（指平均寿命与死亡时年龄之差，即YPLL）远大于其他疾病。由此可见，创伤对人类的生命健康和社会发展已构成巨大威胁，应当引起全社会更多的关注。
1 创伤流行病学
现代医学研究表明，创伤像肺癌、冠心病、疟疾等疾病那样，也有一定的流行病学规律可循。所有创伤，特别是交通伤，常好发于一定的人群，如一定的年龄、职业、性别、个人心理素质、文化教养等，随着研究的深入和拓宽，一门新的学科应运而生，这就是创伤流行病学。它是研究创伤发生、影响因素、流行规律和预防措施的一门分支学科［1］。
近年来，不少研究创伤流行病学的学者集中于调查和分析交通事故的好发因素，如人-车-路-环境间的平衡状态，各个环节在造成车祸中的作用等。国内外的统计资料表明，造成车祸的原因很多，但95%左右是人的因素，如司机过劳、驾车时精力不集中、开车前饮酒或服用兴奋剂、超速开车、违章驾驶、行人不遵守交通法规等，共同的特点是安全意识淡薄。由此可见，提高所有道路使用者的交通安全意识，安全教育与惩罚相结合，就可大幅度减少车祸及其所致的伤亡。
另一项重要研究是探讨某些人在生理、心理方面的缺陷而表现出来的一定事故倾向性。如能在考驾驶执照时就进行检测，查出有事故倾向性的人，不发给驾驶执照或进行特殊培训，则可消除引起车祸的部分隐患。
2 道路交通伤
全球每年因交通事故致死人数约120万人，受伤约3 000万至5 000万人。
WTO预计，至2020年，道路交通伤致死和致残人数将增加60%，在全球疾病和伤害负担（含早死和伤残所致的寿命损失年数）中将由1990年的第9位跃升至第3位［2］。
行人、骑自行车者、摩托车手、电动自行车者受到的保护最少，是“易受伤的道路使用者”，欧洲的一项研究显示，按出行公里数计算，与小轿车驾驶员死于车祸的可能性相比，骑自行车者是8倍，步行者是9倍，骑摩托车者是12倍［2］。
2004年，我国道路交通事故517 889起，死107 077人，伤480 864人，直接经济损失约24亿元人民币，万车死亡率9.93人，10万人口死亡率8.24人［3］，是车祸和死亡人数最多的国家。
近20年来，国内交通医学方面作了不少工作［4-7］，主要进展有以下几方面。
2.1 实验平台 在第三军医大学交通医学研究所建立了不同大小和功能的生物撞击机实验平台，可以做不同大小动物的交通伤模拟实验；2004年又建立了轨道式生物撞击机实验室，可进行实车碰撞，真实模拟乘员和行人的交通伤。
2.2 生物力学 先后对颅脑、胸部、腹部、脊柱等部位交通伤的生物力学机制进行较广泛的研究。提出了颅内应力集中和剪切力是引起颅脑损伤的主要原因；高速牵张变形致心脏破裂；剪切力致肺表面损伤；微血管扩张性撕裂致肺内出血；腹腔脏器不均匀性的相对位移和变形致脏器撕裂和肝内血流压力剧增，由此发生肝内点片状出血；此外，还揭示粘性标准（即躯干变形的瞬间速度V与压缩程度C的最大乘积）与伤情的关系最为密切，两者间呈“S”形曲线关系，粘性标准可作为有效的伤情指数和诊断指标。
2.3 救治 1986年，政府公布“120”为全国统一的急救电话号码，从而有效地提高了交通伤救治水平。全国各地参考国外急救医疗服务系统（EMSS）建立了急救网，除院前救治外，还强化了急诊科救治和重症监护室救治，三个环节相互衔接。一些大医院开展了“一体化”救治，提出入院后救治的“黄金1小时”和“铂金10分钟”的理念，从而提高了救治水平，但也存在不少问题，如院前急救网不够健全，到达现场时间不够快，急诊科与各专科的关系还不够规范等等。
2.4 交通心理 主要研究驾驶员的知觉和认知（如反应时间、动态视觉、判读距离、注意广度等）、状态（疲劳、精神压力、清醒程度等）、事故倾向性（约6%～8%的驾驶员有事故倾向性，造成的车祸占30%～40%）等。
3 组织工程和组织修复
组织工程是近20多年来发展起来的一项新的医疗技术，它不仅提供了新的治疗方法，而且提出了复制“组织”、“器官”的新理念。其基本原理是：从机体获取少量活组织，将其中的功能细胞分离出来进行体外培养扩增，然后与可降解吸收的三维支架材料按一定比例混合，植入体内病损部位，最后形成所需要的组织或器官，以达到创伤修复和功能重建的目的［8］。
动物实验显示，应用骨髓基质干细胞（BMSC）修复关节软骨缺损和应用脂肪干细胞体外构建软骨等均获得初步效果。临床上，用患者自体骨髓基质干细胞作为种子细胞修复颅骨缺损、齿槽裂骨缺损、颅面部骨凹陷畸形及四肢骨缺损填充等也取得较为满意的疗效。组织工程化骨可在缺损区内长期稳定存在（随访3年以上），基本恢复了患区支撑、保护等原有功能［9］。组织工程皮肤已有数种商品，并已广泛应用于临床［10，11］。实验显示，在表皮、真皮及毛囊等部位均已成功分离培养出增殖力很强的皮肤干细胞。
用猪自体真皮成纤维细胞为种子细胞，也成功修复自体的肌腱缺损，其形态和功能与正常肌腱非常接近［9］。
最近研究还表明，成年人第二代真皮成纤维细胞与第二代肌腱细胞基因表达谱极其相似，从而提示今后有可能用成纤维细胞作为肌腱组织工程种子细胞以修复缺损的肌腱。
干细胞在组织修复中有重要作用。有证据表明，在皮脂腺、毛囊周围的干细胞具有多潜能性，这类干细胞可迁移至毛囊以外产生新生的上皮，真皮中的某些干细胞可产生软骨、肌肉、神经元类的细胞。毛囊周围的祖细胞在创伤时可变为成纤维细胞。肌肉的再生可来源于骨髓源性的多能干细胞及神经干细胞。神经干细胞可诱导成星形胶质细胞，重建损伤前的微环境，也可诱导成少突胶质细胞，促进髓鞘的再形成。利用成体干细胞可塑性治疗心肌梗死和下肢缺血性疾病已获得初步成效［12］。
利用组织工程制成具有活性表皮和真皮结构的复合皮肤。应用脱细胞异体真皮作为支架，与网状自体薄皮片复合移植，其皮片韧性、外观收缩程度均较为理想［13］。
4 损伤控制手术
损伤控制手术（damage control operation， DCO）是近20年来提出并应用的实用外科原则，其目的是稳定伤情，避免生理潜能进行性消耗，为确定性手术赢得时间。
大多数严重多发伤可按常规手术方式进行，仅少数患者生理潜能临近或已达到极限，虽然技术上可完成Ⅰ期修复和重建，但机体本身难以承受或环境不允许，此时需作DCO，适应证的选择取决于以下几个方面。①环境因素：如前线手术队或事故现场离大医院很远。②生理潜能参数：如复苏和手术时间＞90min；严重代谢性酸中毒pH＜7.30；体温＜35℃；凝血机制紊乱或机械性出血；输血量＞10单位。根据上述生理潜能参数作为DCO适应证常为时已晚，故应在这之前实施。③创伤类型：这是决定DCO的主要依据，如高动能躯干钝性创伤；多发性躯干穿透伤；大血管伴多脏器伤；多体腔内致命性大出血；复杂脏器损伤等［14］。
治疗步骤如下：
4.1 急救手术 控制出血和感染，作胃小肠破裂修补，紧急时仅用钳夹住空腔脏器破裂处、结肠造瘘等，简易关闭胸腹腔。
4.2重症监护 手术后尽快送至重症监护室处理，主要任务是恢复血容量、复温、纠正凝血机制紊乱、纠正代谢性酸中毒。
4.3 确定性手术 待生理功能基本恢复正常后，作确定性手术。
5 颅脑伤
最近美国国立神经疾病与脑卒中研究所（NINDS）对大宗病例进行了分析，结果显示，在谷氨酸受体拮抗剂、激素、自由基清除剂、钙拮抗剂、生长激素/胰岛素样生长因子、缓激肽拮抗剂、抗癫痫药等药物都没有对颅脑创伤有确切的临床治疗效果［15］。
目前认为有希望的药物包括：黄体酮、镁离子、大剂量白蛋白和胆碱脂酶抑制剂——安理申等，但尚需大量临床研究方可得出结论。
弥漫性轴索损伤（DAI）在重型颅脑损伤中发生率为28%～42%。创伤可引发非离断性轴索损伤，胞浆蛋白降解酶如Calpain抑制剂能减少伤后轴索肿胀及继发性断离。
多中心前瞻性临床对照研究发现，重型颅脑损伤合并恶性颅内压增高，标准外伤大骨瓣减压既简单又安全，疗效优于常用开颅骨瓣［16］。
颅脑伤后的继发性损伤已引起广泛重视。目前研究认为，内源性损害因子如乙酰胆碱、兴奋性氨基酸、内源性阿片肽、氧自由基以及炎症反应失控等是继发性脑损害发生的主要机制。
已发现神经干细胞在一定条件下能分化成神经元，已有人从颅脑损伤病人的脑挫伤组织中分离出神经干细胞，体外增殖后再输入脑挫伤区，期望能促进脑功能恢复［16］。
6 创伤骨折
6.1 骨折复位技术的发展 近年来AO学者提出的生物学固定新概念（biological osteosythesis，BO），已在我国创伤骨科界得到认可，其主要内容包括：①远离骨折部位进行复位以保护骨折局部软组织的附着；②不强求骨折的解剖复位，关节内骨折仍要求解剖复位；③使用低弹性模量的内固定物；④减少内固定物与骨皮质之间的接触面积。在此理念的影响下，间接复位技术相应问世，这一技术又被称为韧带整复术（ligamentotaxis）。由于骨端血供破坏少，骨愈合的速度较直视下的解剖复位明显加快，这对粉碎性骨折尤为有利［16］。
6.2 骨折固定系统的发展 在BO概念指导下，配合间接复位技术，内固定系统在材料和构型上都有很大发展。低弹性模量固定物材料仍以钛合金材料最为理想。
6.3 骨组织工程的研究 是组织工程研究领域中最为活跃的一部分，组织工程学的发展将为创伤骨科的临床治疗提供新的治疗手段与技术。
7 结束语
创伤的基础和临床研究近年来均取得较大的进展，但是距离保护人民健康的要求仍相差甚远。创伤，特别是交通伤，急剧增多的势头尚未得到有效的遏制。
应当强调，创伤在很大程度上是可以预防的，如果预防工作做得好，全民预防伤害的意识提高，创伤会大为减少。其次，创伤医学与诸多学科相互交叉，既涉及到预防医学、临床医学和基础医学，又与医学以外的其他学科密切相关，如能做到多学科的协作研究，特别是医学和工程技术两方面专家密切合作，必将会大大降低创伤的发生率和死亡率。
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胸导管壶腹的形态学研究 邹智荣，毕玉顺，刘执玉，周小龙，李贵宝，王伟
前列腺术前注药及改良耻骨上经膀胱前列腺摘除术初探 黄祥，格桑
基质金属蛋白酶与肿瘤侵袭转移 刘智敏，王凡
5-羟色胺(5-HT)与胃粘膜损伤和修复关系的研究现状 唐旭，王泽，邓才宝，张苏
肥大细胞的异质性 陈晓宇，贾友苏
体质人类学研究二十年及其启示 胡兴宇，蓝顺清
左侧椎动脉起自主动脉弓一例 邹智荣，陈绍春，李仲铭
随想克隆 孙昭
多媒体技术在组织学教学中应用 陈海英
《人体解剖学》教学中课堂气氛的创立 董武忠，刘振远
浅析目标教学中的课后补救 胡文礼
《人体解剖学》教学中板图的应用 刘振远，罗卫民
中专解剖学教学中"双差"生的思考与对策 易前忠，叶常青
临床医学专科起点本科班《临床应用解剖学》教学探讨 朱建华，洪永华，李克攻
教育改革浅见 黄启林
护理专业《解剖学》学习成绩的现状与对策 潘玉康，雷秀兵
现代教育技术在人体解剖学教学中应用的思考 马大军，雍刘军，刘兴国
人体断层解剖学教学的探讨 刘卫华，刘兴国，马大军，米永杰
谈解剖教学中的学生能力培养 易前忠
解剖学有关口区的一些名词概念的探讨 雷秀兵，潘玉康，杨阳
扩展实验教学培养综合能力 王小标
我怎样通过试讲 蒋艳萍
绘图法在解剖学教学中的应用 林达
如何配合"大局解小系统"教学制作示教标本 宋涛，李贵宝
《心血管系统解剖》课件的制作和应用 初国良，黄海，彭映基，汪华侨
结肠巨大囊肿伴先天性阑尾缺如一例 赵亮，董浩，胡乃文，刘执玉，刘立平
“纲(功能)举目(形态)张”——组织学教学方法探讨 彭彬，黄安培
组织学实验考试方法的探讨 李中华
初生牛脊髓神经细胞尼氏体硫堇——伊红染色法 房丽华
家鼠类肾上腺嗜铬细胞简易染色法 李莉
普通墨汁对中、小血管行荧光染色 钟瑞冲，林卡莉
用撕片法显示胎儿小肠壁外纵肌外侧面微血管分布 李银生，汪艳丽
血液涂片Wright染色法的改进 陈大堤
硫堇块染色法显示神经元尼氏体的体会 孙万彬，赵春芳，谷双魁，赵京山
采用犀牛牌双面不锈钢刀片制作石蜡切片 毕彦忠，陈福来，罗英铎
神经纤维快速染色改良法 毕彦忠，金晓明，陈福来，黄琪，罗英铎
影响人胚胎脑组织冷藏因素的研究 张华
潘氏细胞固定和染色法探讨 闫爱华，任知春，任秀花
运动神经末梢显示方法探讨 闫爱华，任秀花，任知春
网织红细胞的显示及体会 任秀花，闫爱华，任知春
糖尿病大鼠视网膜血管铺片技术的改进及运用 潘琳，盛瑞红，彭俊云，周水平
骨磨片封片的探讨 宋林，糜建红
一种显示网状纤维的方法 廖大清，马玉琼，陈思秀
Mallory三色法在小肠染色上的应用 陈思秀，廖大清，马玉琼
制作疏松结缔组织教学铺片的探索 马玉琼，陈思秀，廖大清
石蜡切片H-E染色法的经验和体会 朱丽华，张丽敏，王春燕，孙孝庸
大鼠中枢神经系统连续切片显示神经核团 陈德英
观察大鼠胚胎心内膜垫发育时的切面选择 肖虹蕾，喻青
铺片在结膜杯状细胞研究中的应用 佘振珏，柯碧莲，周国民
不同组织固定液与巴氏染色法异染性现象 韩亚京
肥大细胞数量及脱颗粒变化在小鼠妊娠早期子宫中的观察 吕丹瑜，杨京京，刘斌
10%福尔马林与中尔马林的比较 张宝元
改良溃变神经纤维镀染方法经验介绍 买鸿宴，杨立元，杨磊，雷季良
湖南侗族耳的活体观测与研究 吴亿中，皮建辉，何培森
复方丹参注射液对大鼠急性脊髓损伤后神经再生的影响 刘德明，王文敏，刘曾旭，
下颌第一前磨牙根管系统和根尖孔解剖及临床意义 张玉，邓德华
以锁骨内侧端最高点为标志行右静脉角部穿刺的应用解剖 孙国刚，刘玉林，聂红艺，屈强
肌性动脉内弹性膜的观察分析 程基焱，刘广益，吴雨岭，先雄兵
MERlIN的分子结构及特性 陈永锋，齐建国，章为
胰岛素样生长因子对神经干细胞增殖分化的影响 龙庭凤，刘广益，郭勇，余鸿
双侧巨输尿管畸形一例 杨朝鲜，曾昭明
干细胞调控机制及体外培养影响因素的研究 何红媛，王萍，夏冬，吴绍华
足内侧皮瓣的解剖学研究及临床应用 杨开明，徐达传
针刺镇痛及其机理 柯青，王廷华，赵有成
淋巴细胞归巢至肠粘膜组织的分子机理 吴琦，张立平
探索调控人胚分化发育相关基因的时空表达 欧阳秋明，曾苏，孟珊珊
中枢多巴胺系统与阿尔茨海默病 侯海龙，陈晓蓉，胡祥友
心肌细胞凋亡与高血压 金迅，靳秋月，何文彤
急性脊髓损伤后aFGF、bFGF的表达 李卫峰，王玮
超声检测妊娠中胎儿的标准化问题 杨太珠，贺延富，罗红，郭文琪，孙昭
谈解剖学教学中的正迁移 吴仲敏
用三种软件编制解剖学电子讲稿的体会 伍家农，张光鹏
关键词：流式细胞术；临床医学；应用
近年来，随着单克隆抗体的应用及流式细胞术的快速发展，流式细胞术（FCM）已成为许多疾病诊断和分性的重要依据。流式细胞术是20世纪70年展起来的一项高新技术，它作为一门生物检测技术集计算机技术、测量技术、激光技术、流体动力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，是对快速直线运动状态中的细胞、生物颗粒或液体中的大分子物质进行多参数的、快速的定量分析和分选的一种技术［1］。1973年美国BD公司推出全国第一台流式细胞仪，通过对流动液体中排列成单列细胞或颗粒进行逐个检测得到该细胞或颗粒的光散射和荧光指标，分析它们的体积、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等物理及化学性质，还能对所需要的细胞进行分选等。具有检测速度快、测量指标多、采集数量大，对所需的细胞或生物颗粒进行分析或分选等特点［2］，其在生物学、临床医学、遗传免疫学、肿瘤学等众多研究领域得到广泛应用。
1流式细胞仪的结构及工作原理
1．1流式细胞仪的结构
主要由五部分组成：（1）流动室及液流驱动系统；（2）激光光源及光束形成系统；（3）光学系统；（4）信号检测与储存、显示、分析系统；（5）细胞分选系统。
1．2流式细胞仪的工作原理
将待测细胞染色后制成单细胞悬液，用一定压力将待测样品压入流动室，不含细胞的硫酸缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流成一定角度，这样鞘液就能够包绕样品高速流动，组成一个圆形的流束，待测细胞在鞘液的包绕下单行排列，依次通过检测区域。流式细胞仪通常以激光作为光源，经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光，这两种信号同时被前向光电二极管和90°方向的光电倍增管接收，光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号，这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原的强度或核内物质的浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模／数转换器将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，计算机系统将这些数字信号收集、储存，以一维直方图或二维点阵图及数据表或三维图形显示出来，可以用不同的标记物进行双参数、三参数甚至多参数的分析［3，4］。
2流式细胞仪的技术指标
包括：（1）分析速度：很高可以达到5000个／s左右，大型的流式细胞仪的分析速度可达10000个／s；（2）荧光检测灵敏度：单个细胞上的荧光分子＜600个，或两个细胞之间的荧光差＞5％就能区分；（3）前向角散射光检测灵敏度：一般的可以检测到的最小颗粒直径在0．2～0．5μm；（4）分辨率（CV）：一般流式细胞仪能够达到＜2．0％；（5）分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞100个／s，分选细胞纯度可达99％［5］。
3流式细胞术在临床中的应用
3．1在血液学中的应用
流式细胞术通过对外周血细胞和骨髓细胞表面抗原和DNA的检测分析对各种血液病如白血病、淋巴瘤等血液系统疾病的分型、诊断、治疗及预后判断均有重要作用。血细胞在白细胞系、红细胞系、巨核细胞系、血小板及非造血细胞均有不同的分化抗原表达，分布在细胞质、细胞膜中。血液肿瘤细胞的特征是丧失了正常细胞的系类专一性和分化阶段的规律性，运用流式细胞术将具有系列特异性并涵盖不同分化阶段的单克隆体作为分子探针来检测血液肿瘤细胞的内外抗原，可以反映其本质上与正常造血细胞的差异［6］。流式细胞术采用各种抗血细胞表面分化抗原的单克隆抗体，借助于各种荧光染料（异硫氰基荧光素FITC，藻红蛋白PE等）测定一个细胞的多种参数，以正确判断出该细胞的属性。流式细胞术还可以应用在白血病免疫分型方面，目前国内外均主张采用FCMCD45／SSC双参数散点图设计方法进行白血病免疫分析。采用此法可将骨髓细胞清晰地分成淋巴细胞、单核细胞、成熟粒细胞、幼稚细胞和有核红细胞群，这样可以排除正常细胞对免疫分型的干扰，从而提高免疫分析的准确性，而且测量细胞一般在1～5万个细胞，快速特异、准确性好，并且能够提供正常细胞在演变成恶性肿瘤过程细胞基因及抗原标志发生变化的信息。而这种细胞的变化是常规FAB法所不能分辨的。这种分型对于治疗方案的正确选择与预后有着重要的意义同时也提供了可靠的依据［7］。近年研究发现，在临床血液病检测和诊断中诊断准确率高达90％以上，与普通检测法相比准确率提高达20％［8］。流式细胞术可以通过某些荧光染料与红细胞中的RNA结合，定量地测定网织红细胞中的RNA，得到网织红细胞占成熟红细胞的百分比，从而准确地反映骨髓造血功能。有作者报道FCM方法比目测法结果精确度更高［9］。此外FCM还可以测出网织红细胞的成熟度，对红细胞增值能力的判断很有意义，为干细胞移植术后恢复的判断、贫血的治疗监测、肿瘤患者放化疗对骨髓的抑制状况等提供依据。
3．2在肿瘤学中的应用
流式细胞术在肿瘤学中的应用主要是对肿瘤细胞DNA含量进行测定，包括癌前病变及早期癌变的检出，辅助肿瘤的早期诊断和鉴别诊断。不仅如此，还可以根据化疗过程中肿瘤DNA分布直方图的变化评估疗效，了解细胞动力学的变化。临床医生可根据各细胞周期各时相的分布情况，结合化疗药物对细胞动力学的干扰理论，设计最佳治疗方案，再依照DNA直方图直接地看到肿瘤细胞的杀伤变化，及时调整治疗方案，选取有效药物以使对肿瘤细胞达到最大的杀伤效果［10］。
3．3在免疫学中的应用
利用抗原抗体特异性反应的原理将流式细胞仪与单克隆抗体结合，对细胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体进行定量检测，广泛应用于临床，对人体细胞免疫功能的评估具有重要的意义。流式细胞术可进行T、B和NK淋巴细胞水平的分析，还可以进行淋巴细胞亚群的分析，区分不同的淋巴细胞亚群，计算其相互间的比例，进而了解淋巴细胞的分化功能。更重要的是，通过研究大多数疾病的特异性淋巴细胞亚群，对一些疾病如免疫性疾病、感染性疾病、肿瘤等的诊断、治疗、免疫功能的重建具有重要的指导意义。例如CD4是辅淋巴细胞，它是迟发性超敏反应的启动者，是促使B淋巴细胞产生抗体的辅细胞，也是抑制性T细胞的诱导细胞，而CD8是抑制性T细胞，是细胞毒性T细胞介导反应的效应细胞，是抑制B细胞产生抗体的抑制性细胞［11］。在许多免疫性疾病中，淋巴细胞亚群的增多与减少对疾病的发展具有重要的作用。如在先天性发育不良综合征中FCM分析显示外周血CD3TCD4＋和CD8＋T细胞均减少，在残余T细胞中T细胞受体（TCR）αβ分子表达减少，γδ分子表达正常，CD4＋／CD8＋T细胞比例升高，随着受累者年龄的增加CD8＋细胞数增多，而有些患者T细胞数量增加，最终可达正常［12］。流式细胞术还可以进行HLA群体分析，在强直性脊柱炎患者中用流式细胞术检测HLA－B27抗原阳性率高达92．6％，而且可以排除交叉反应，提高检测的灵敏度和准确性［13］。
3．4在中医药研究方面的应用
流式细胞术可用于单味中药有效成分的作用效果测定分析。如研究复方苦参方剂对大肠癌LoVo细胞体外增值凋亡的影响中，分析DNA含量及细胞周期，结果显示Lo－Vo细胞可检测亚G1峰，凋亡率于对照组相对比例增高，细胞周期分析发现S期阻滞现象，表明复方苦参方剂具有一定的抑制肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的作用［14］。在慢性阻塞性肺疾病的肺气虚证、肺阴虚证患者中CD4＋、CD4＋／CD8＋均降低，CD8＋升高，说明肺气虚证与肺阴虚证患者均存在细胞免疫功能低下［15］。
3．5在细菌学中的应用
流式细胞术具有快速、灵敏、精确并能进行多参数分析的特点，可广泛应用于细菌的诊断和药敏实验，是研究细菌异质性、细菌抗生素后效应、多种病原菌混合感染等的有效方法。常用的为流式细胞术药敏试验：检测不同细菌时，根据药物对细菌的作用机理选择合适的荧光染料，通过细菌总体平均荧光强度束反映抗生素对细菌的抗菌活性，3h左右即可得出检测结果，尤其适用于急需药敏报告的重症感染病菌的检测。
3．6在血小板疾病诊断中的作用
血小板是止血机制中一个重要因素，其表面含有多种糖蛋白及各种受体，这些受体与相应的配体相结合后，血小板被激活，并发生形态变化，血小板聚集和颗粒释放等一系列反应。利用流式细胞术检测血小板标志物在许多血小板相关疾病的诊断上具有重要的临床价值［16］。如GPⅠb／Ⅸ复合物先天缺陷导致巨大血小板综合征；GPⅡb／Ⅲa复合物先天缺陷导致血小板无力症［17］。在免疫性血小板减少性紫癜的患者中，FCM可以测定患者血液中的PAIgG、PAIgM、PAIgA，荧光阳性百分率的诊断效率为45．8％，平均荧光强度的诊断效率为72．5％，两项指标联合的诊断效率为74．2％［18］；因此FCM检测血小板抗体可用于免疫性血小板减少性紫癜的诊断及治疗监测。用FCM内参定位法定量分析血小板微粒在血栓性疾病和血栓前状态的发生发展中的作用，有利于血栓性疾病的诊断和治疗。
3．7在相关疾病检测中的应用
质量检测是诊断男性不育症的重要手段，由于检测数低及主观因素的影响，常规的检查只能反映的形态特征和有限的功能，不能为生育能力提供准确评估的依据，用FCM检查可把定性的描述变成定量的研究，提高了实验结果的准确性，可对进行高通量、多参数分析，得到不同时期的细胞数据及形态指标，对临床诊断发生障碍的性质、原因和程度提高了客观依据，可对少、弱和无症的判断、治疗及疗效的观察作出正确的评价，为客观评价男性生育能力提供了有力的依据。用FCM检测生精细胞凋亡情况是迅速、准确、客观、可靠地评估功能和男性生育力的新方法［19］。
3．8在器官移植中的作用
可用流式细胞术判断供者与受者之间的配型是否合适。检测受者血清中抗供者的抗HLA抗体，如果受者血清中存在针对供者的循环抗体，就会同供者的淋巴细胞结合，在加入荧光素的二抗来显示这种结合，就可在移植前后发现高风险抗体，以判断供者与受者之间是否合适。移植后的免疫表型监测也很重要，移植后的CD4／CD8比值低下的患者排斥反应发生较多，受者血清中产生抗供体细胞抗体预后较差，应及时监测以便进行抗排斥的预防和治疗［4］。综上所述，流式细胞术是一种在医学基础、临床及科学研究中具有广泛应用前景的细胞分析技术。它具有分辨率高、分辨细胞数量大、参数多、准确性高、速度快等优点。随着流式细胞分析技术与方法的迅速发展，流式细胞术在临床的应用范围也不断拓展，并将成为推动临床医学发展的重要手段。
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皮肤美容自古有之。当代皮肤美容始于20世纪60～70年代，20世纪70年代后期出现皮肤扩张术、皮肤磨削术和化学剥脱术等，20世纪90年代中后期现代激光在皮肤美容中广泛应用。美容皮肤科学是祖国传统医学皮肤美容精华、医学美学、皮肤科学与先进美容技术相结合的产物。美容皮肤科学又是现代皮肤科学中不可缺少的重要组成部分，它丰富和发展了传统的皮肤科学。
美容皮肤科学(Cosmetic dermatology)是一门以医学美学为指导，皮肤科学为基础，研究人体皮肤的机能与结构，维护、改善、修复和塑造人体皮肤的健康与美的规律的美容医学分支学科。它是美学、美容学与皮肤科学三者有机结合的产物，目的是为了提高人的生命活力与美感，提高人的生命质量、生存质量及生活质量。美容皮肤科学既是美容医学(cosmetic medicine)和医学美容学(medicalcosmetology)的一个分支学科和重要的组成部分，也是皮肤科学的一个新的分支学科。它是结合医学美容的方式来维护和增进人体皮肤健与美的一门新的医学分支学科。美容皮肤科学以皮肤科学为基础，并吸收了中医皮肤美容、皮肤外科、美容医学其他分支学科的临床实践经验及各种行之有效的物理、化学与药物美容、心理美容等技术的丰富营养，使其赋予了新的内涵。
2 美容皮肤科学治疗方法的发展与挑战
美容方法学是一项新的皮肤美容技术，它是由皮肤生理学、化妆品学及美容技艺学组成的一门新兴学科，它不仅为患者提供了新的审美选择，同时也为医生提供扩大就业的机会。下面将国内外发展较快的美容治疗学方法介绍如下：
2.1 肉毒杆菌毒素(BTX)：肉毒杆菌毒素是肉毒杆菌产生的毒素，是一种强烈的神经毒素，其生物学作用是在神经肌肉接头处阻滞神经末梢释放乙酰胆碱，从而用于治疗各种痉挛、强直以及震颤性疾病。BTX在美容整形领域的应用是由Carru thers(1992年)首先报道，在治疗眼肌痉挛时皱眉纹也同时消除。2001年，自加拿大、美国、欧洲和日本相继批准肉毒毒素用于面部除皱以来发展很快，到2004年已成为美国整形外科医生开展的占第一位的非手术治疗项目。肉毒杆菌毒素(BTX)A和B已成功地使用于美容皮肤病和相关疾病的治疗，如：多汗症、炎性疾病、直肠病以及其他的症候。BTX－A不仅有效地抑制了乙酰胆碱而且还抑制P物质和谷氨酸盐，因此可以治疗不同类型的湿疹。由于这些机制BTX－A可以止痒用于治疗单纯苔藓、水泡型手部湿疹。在美容治疗中肉毒毒素是非常有效和安全的，但有注射时疼痛的副作用。4％利多卡因表面麻醉霜可缓解局部的疼痛，因此，在美容治疗中提倡使用局部麻醉剂。肉毒毒素还被用来与其他治疗方法联合应用，因其安全、有效、操作简单、使用方便和副作用小的特点，一直有很高的满意度，越来越受到广大求美者和医护人员的欢迎。但肉毒毒素的副作用也正在被重视，需要严格把握适应证及药物剂量和用药频率。
2.2 光动力疗法(PDT)：光动力治疗在不同的医学专业领域的利用发展迅速，通过在皮肤病中有效地利用光生物学的光能量和分子氧，在组织光学中选择性破坏病理细胞。最近发展了联合局部的光增敏剂5－6氨基－γ－酮戊酸(ALA)或它的甲酯(MAL)诱导光敏化卟啉，后者不产生强烈的全身性光敏作用，并且易于进入皮肤导致光激活。光动力治疗中单线态氧取决于病变组织中所应用光的剂量、浓度和局部的光敏(化)剂。局部光动力治疗皮肤肿瘤性疾病：光化性角化病、Bowen's病、原位鳞状细胞癌、基底细胞癌，以及非新生物皮肤病局限性硬皮病、寻常痤疮和病毒性疣。一般认为PDT的作用机理是通过细胞毒性效应导致肿瘤破坏或免疫调节的作用改善皮肤炎症状态8-93。在美国FDA已推荐用于光化性角化病，在欧洲不仅用于光化性角化病和基底细胞癌，还用于Bowen's病、银屑病、皮肤T细胞淋巴瘤和痤疮，近年来又用于皮肤年轻化。它的优势是非侵袭性的靶向治疗通过受累面积局部用药和局部照射，很少有痛苦和不适。光动力疗法(PDT)与5－δ氨基－γ－酮戊酸(ALA)结合使用在治疗多种皮肤病中受到了医生和患者的欢迎。光动力学疗法(PDT)与5－δ氨基－γ－酮戊酸(ALA)使得许多皮肤病得到了明显的改善，专家一致认为ALA－PDT治疗光化性角化病、浅表性基底细胞癌、光子嫩肤、痤疮、脂性皮肤、酒渣鼻、鼻赘及常见的皮肤病是安全和有效的。光动力疗法治疗浅表的基底细胞癌(BCCs)、Bowen's病报道有效率达85％～90％，同时也是优秀的美容治疗。特别对老年患者效果更为突出，可能与他们活动量小有关。由于它的通用性、安全性、多效性及美容功能的优势，ALA－PDT将很快成为临床应用的主流。
2.3 非剥脱性的皮肤年轻化技术：非剥脱性激光技术包括激光、强脉冲光及射频。近年来，激光美容因为安全和有效被越来越多的求美者所接受和信赖。脉冲染料激光(532～595nm)可以改善皮肤的充血，减少浅表皮肤色素斑；二极管激光(Smooth Beam，1450nm)和Nd：YAG激光(Cool Touch，1320nm)换肤，通过选择性破坏含水量多的真皮浅层，靶向为水分子，穿透力强，引起细胞反应以形成新的胶原，同时也有皮肤收缩作用，特别眼睑部更为明显。激光皮肤治疗技术就是利用激光对病损组织进行修复和皮肤整形的过程。激光不仅可治愈各种胎记，也能治疗雀斑、文身、眼眉色斑、鲜红斑痣及多种色素和血管类皮肤病(如：色素性荨麻疹、下肢毛细血管扩张、酒糟鼻等)。激光治疗皮肤病具有出血少、不留瘢痕、安全无痛，复发率少等优点，是一种比较理想的美容方法。
强脉冲光(IPLs)是一种有特殊波长的宽谱可视光，有较柔和的光热效应，在不损伤皮肤的前提下可以达到嫩肤、祛斑、除皱及脱毛的美容效果。作为一种利用光热物理作用理论进行嫩肤美容在美容界是一次技术革新，其令人瞩目的临床效果也逐渐被人们所接受。IPLs并不是单一波长的激光，而是为430～1200hm波段的强光，其作用机制是由于皮肤内色素和血红蛋白吸收较短波长强脉冲光最多，因此造成皮肤内色素斑和扩张血管(红血丝)的温度上升而被破坏，因而达到美白皮肤，祛除色素斑，消除扩张的毛细血管的作用。而较长波段的强脉冲光可促进皮肤的胶原增生，增加皮肤弹性，去除细小皱纹，收缩粗大毛孔。不仅可以治疗皮肤毛细血管扩张，对年龄性和日光性皮肤老化、色素斑等有着很好的治疗作用，同时还可提高皮肤的弹性和细腻程度，恢复赋有活力的肌肤。近年来面部皮肤年轻化和IPLs仪器性能的改进以及与激光相比的价格优势导致IPLs的普及使用，IPLs的使用可能超过激光。此外，IPLs抑制皮脂腺的分
泌，杀灭皮脂腺中的丙酸杆菌，促进痤疮瘢痕恢复，治疗瘢痕可以减少红斑、浸润、炎症及肥厚。其优点是简便、快捷，治疗完成后可以立即恢复正常生活和工作。
射频技术(radiofrequency－RF，Therma Cool技术)，也称为射频电流，它是一种高频交流变化电磁波的简称。每秒变化小于1000次的交流电，称为低频电流；大于10000次称为高频电流。RF就属于高频电流，由高频电流转化为热能而起到美容作用。射频能刺激真皮一胶原立即收缩，效果持久明显。治疗后，胶原连续增生，多数可持续3～6个月，甚至达18～24个月；使皮肤皱纹变浅，表面光滑且富有弹性，对于提升面部松弛，亚洲人效果更为满意。临床已证明射频技术结合ELOS除皱改善面部皮肤年轻化是安全有效的，治疗后，患者无需休息，不影响工作。2002年，Weiss 采用单极射频RF配合冷冻剂使得面部皮肤紧致已治疗10000多例，表明不用麻醉剂和镇静剂单极射频RF用于面部紧致是安全的，副作用少，对面部年轻化与其他非侵蚀性设备相比RF副作用要小的多，并且有自其限性。
2.4 药物美容学：它是在医学人体审美的理论原则指导下，运用药物及中药方剂、针灸、按摩、中药护肤品等手段所进行的美容。
皮肤增白药物主要是通过干扰黑素的生物合成、减轻皮肤色素沉着而增白。按其作用机制又分为酪氨酸酶抑制型和非抑制型两类。酪氨酸酶抑制型皮肤增白药物包括单酚和多酚类(如：熊果苷，它是从杜鹃花科植物熊果的叶子中分离得到的一种具有脱色作用的单体物质，能明显抑制黑素细胞的酪氨酸酶活性和黑素产生)、铜离子螯合剂(曲酸及其酯化物等)、阻止酪氨酸酶向前黑素体转移的药物(葡萄糖胺类)、改变黑素体超微结构的药物(癸酸)、促进酪氨酸酶蛋白降解的药物(亚油酸、γ－亚麻酸)、竞争性酪氨酸酶抑制剂(氨甲环酸等)和其他类(胎盘提取物等)。非酪氨酸酶抑制型皮肤增白药物包括抗坏血酸及其衍生物(抗坏血酸等)、角质溶解剂(α－羟酸类等)、抑制黑素细胞增殖药(内皮素受体阻断剂等)及其他类(过氧化氢等)。
肥胖采用药物治疗是重要的治疗手段。目前治疗肥胖症的药物主要有两大类：作用于中枢的药物(西布曲明)一食欲抑制药和作用于外周的药物(奥利司他)。超氧化物歧化酶(SOD)是一种极其有效的抗氧化剂，能抵御超氧阴离子自由基对细胞的破坏。研究显示，SOD是人体内最重要的酶之一，能有效清除超氧阴离子自由基，保持人体细胞膜年青、柔软和健康的状态。氢醌(HQ)的化妆品、粗制品及其活性成分的安全性一直存有争议，氢醌在不超过2％的浓度时可作为一种脱色剂，因为对其结构及不良反应已了解较多，氢醌无疑是目前最有效而且最安全的脱色剂。现已有许多其他脱色剂不断进入市场，产品含有熊果苷、HQ和植物的类似物，包括含有天然的HQ和熊果苷的卉类，仍然在欧洲一些国家使用。HQ的潜在毒性取决于接触途径，啮齿类毒性有很高的性别差异和种群差异。在实验动物发现有肾毒性，皮肤毒性研究未显示有全身毒性反应，在鼠和兔的发育和生殖研究中尚无有意义的结果，对人类的致癌性活体研究尚无资料证实。在非洲的东南部，皮质类固醇作为褪色剂使用是常见的，常常引起类固醇的毒副作用及撤退性皮炎。最新的一种脱色剂就是曲酸，有效性和安全性有待深入研究。
药物在美容领域里有着广泛的应用，中药、西药和中西药结合的方法近年来在痤疮、黄褐斑、增生性瘢痕、扁平疣、斑秃、硬皮病、复发性口疮等损容性疾病的治疗中呈现明显的效果。
3 美容皮肤科学在临床医学中的价值
美容医学发展的意义与作用已超越了传统的健康概念，通过美容手术达到外形的改善与增加美感，它是医学与美学，科学与艺术的结合。它完全顺应了现代医学服务模式的转变，即由单纯的生物医学模式向生物、心理、社会医学模式的转变。
美容皮肤科学的医学价值在于改善损容性皮肤病对人的心理、容貌和形体美的影响，把驱除疾病、调整皮肤的机能与结构、提高心理素质，达到维护、改善、修复和再塑人体皮肤之健美，增进人的生命活力美感，提高生命质量作为主要实施目标。临床中，需要我们进一步科学地借鉴各相关学科的知识和技能手段，诸如美容外科、人体皮肤美学、心理学、伦理学、行为学、物理学以及现代激光、药物代谓学与化学美容护理与保健、医学生物工程、艺术造型等相关学科的知识和技能，不断丰富、发展和完善美容皮肤科学。相信随着科学技术的发展和社会人群审美的需要，美容皮肤科学将会“与时俱进”，不断扩展。
4 美容皮肤科学前景广阔，任重道远
美丽的容颜和健美的体态是人们追求的目标，美容美体是人类进化的产物，是生产力发展、社会文明的标志。随着社会的发展、生活水平的提高，人们对美的要求越来越迫切和强烈，对美容皮肤医学提出了更高的要求。医学美容正面临着巨大的发展机遇。
皮肤老化是自然老化与环境诱导过程的老化结合。自然老化是生命过程中的必然规律，但是在一定条件下我们可以延缓衰老的发生，主要是进行抗氧化治疗。光老化是指在长期日光照射下，引起皮肤外观、结构及功能改变的老化。而日光中的紫外线与皮肤光老化的发生密切相关。阳光照射产生急性和慢性的损伤，紫外线(UV)照射产生免疫抑制现象，这个现象已引起不同学科的关注，如：皮肤病学、免疫学、光生物学。尽管发生机制一直在争论，uV的免疫抑制形成皮肤恶性肿瘤(黑素瘤和非黑素瘤)的事实不能回避。
