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关键词：羊草；分子生物学；遗传多样性；组织培养；基因克隆
中图分类号：S543.901 文献标识码：A 文章编号：1007-7847(2007)04-0289-06
羊草(Leymus chinensis)是多年生禾本科赖草属草本植物，由于其环境适应性较强。具有耐寒、耐旱、耐盐碱等优点而成为松嫩平原的优势物种，同时羊草也是一种重要的牧草资源，蛋白质含量高，适口性好，耐践踏，在发展草原畜牧业方面具有重大的经济和社会效益，但羊草种子发芽率低、种子萌发最适pH值为8.0～8.5，加上过变放牧和草地盐碱化日益加重等原因，我国现存系统管理重点实验室项目(K09M6)羊草草地约有90％以上发生了不同程度的退化，因此，研究羊草的遗传分化、抗逆机理、栽培育种以及转基因等对于改善生态环境和草场建设具有重要意义，随着分子生物学对各个学科的交叉渗透，使羊草的研究从细胞水平进一步深入到分子水平，羊草属于异交植物，物种趋向于在种群中具有较高水平的变异性，仅在松嫩草原中西部靠近内蒙古高原东部草原上的羊草种群就数以千计，这为研究羊草种群的遗传多样性提供了对象，培养愈伤组织是进行羊草转基因研究的前期工作，但诱导率低的问题尚未得到解决，笔者结合自己的科研工作，对羊草分子生物学领域的研究成果加以综述，旨为羊草抗逆分子机理研究提供参考资料。
1 羊草遗传多样性研究
由于羊草生态适应性强、分布范围广、生境类型多样，在长期的适应和进化过程中，羊草种群之间在形态、生理、生态以及遗传特征方面均产生了趋异，RAPD(randomly amplified polymorphic DNA，随机扩增多态DNA)技术可以在对被检对象无任何分子生物学资料的情况下对其基因组进行分析，而且具有费用较低、方便易行、模板DNA用量少、不需要同位素，在安全性和实验操作上具有比AFLP(amplified fragment length polymorphism，扩增酶切片段多态性)、SSR(simple sequence rc-peat，微卫星重复序列)等分子标记更加简便易行等优点，从而使其成为目前研究羊草遗传多样性的最重要的手段之一，该技术主要是利用各种群羊草的总基因组DNA作为模版，筛选能够扩增出具有明显差异性条带的随机引物，以至少两次重复均出现的结果做0，1矩阵图，即有条带记为1，无条带记为0，计算总片段数及多态位点百分率、各种群间遗传相似系数和遗传距离，利用分析软件进行聚类分析从而得到其遗传结构树状图，
羊草RAPD分析可以用于研究羊草的种群关系以及遗传分化的影响因子，崔继哲等应用RAPD技术证明相似生境或同一地域的种群在一些位点上表现出相似或相同的变化，刘惠芬等运用RAPD技术对内蒙古典型草原不同生境8个羊草种群进行分析，聚类结果显示生境相似的种群能够聚在一起，而地理距离最近的种群不一定归为一类，说明小范围内羊草种群间的遗传分化与地理距离不存在相关性，而与其生境间的相似度相关，影响遗传相似性的不是单一因子而是各种因子的综合作用，较小地理范围内羊草种群间的遗传分化主要是由环境的异质性所引起的，笔者曾以采自中国大安碱地生态试验站(N45°36′，E123°53′)的羊草种子单株播种栽培，以每株羊草幼苗的地上部为材料进行RAPD分析，30个实验样品的平均遗传距离为0.1909，共可分为4个类群(待发表)，通过RAPD分析，还可以进一步将羊草遗传分化多样性的原因具体化，汪恩华等””利用分子标记与形态标记以21个有效随机引物中对9份羊草材料进行RAPD分析，对随机抽取的17份禾草种质进行了种质评估的比较研究，结果表明，羊草种质的小穗数、种子千粒重、叶色、有性繁殖量和结实率5个形态学指标与遗传多样性指标存在一定的相关性，应用RAPD技术对不同生境羊草在水分胁迫下游离脯氨酸含量的变化做聚类图比较分析，证实水分是影响羊草种群间遗传变异和生态型分化的一个最主要的因子，虽然水因子是影响羊草分化的一个主导因子，但是在实际研究工作中也认识到羊草变异和分化是多种生态因子综合起作用的结果(如温度、海拔、经纬度、土壤类型等)，而且各因子之间又是相互影响，在不同的生境中限制因子又是变换的，这就造成不同地理种群的羊草遗传分化过程的复杂性，由此可见，目前以羊草为实验材料的RAPD分析虽有许多报道。但是由于羊草本身具有较高的种群变异性。组成羊草群落的植物总计有357种，加之尚缺乏一种统一的标准分型方法，因此RAPD技术就成为研究羊草分类及来源的主要工具，在物种鉴定及遗传分化研究中发挥着重要作用。
除了RAPD技术以外，等位酶技术也可用于羊草遗传多样性分析，等位酶是指由一个位点的不同等位基因编码的同种酶的不同类型，其功能相同但氨基酸序列不同，崔继哲等通过该技术，综合分析了松嫩平原11个羊草种群的遗传多样性及遗传分化指标，深入剖析了灰绿型和黄绿型两种叶色类型羊草种群之间的遗传差异，证明种群间的遗传距离与地理距离之间没有相关，崔继哲等还采用淀粉凝胶电泳技术，应用等位酶分析方法测定了松嫩平原南部微生境下羊草灰绿色和黄绿色两种生态型9个种群的遗传多样性和遗传分化程度，证明羊草种、种群和生态型水平都维持较高的遗传多样性，两种生态型之间有明显的遗传多样性差异及遗传分化，另外，对不同生境、不同分类种群的遗传结构分析发现羊草种群遗传变异度很高，但是无论如何归属，松嫩草原上的羊草种群遗传分化程度很低，推测可能与羊草为异花授粉、不同类型混生及种群间基因流强度大有关，刘杰等曾用SSR作为探针构建了羊草的遗传指纹图谱，为羊草种质资源评价、种间及种内亲源关系分析、生物多样性研究提供了有效手段，利用AFLP方法对我国不同地区分布的羊草材料进行的DNA多态性分析结果也表明了羊草基因组DNA具有比较丰富的多态性。
2 羊草愈伤组织培养及利用
植物组织细胞培养(plant tissue and cell cul-ture)是通过运用植物组织细胞培养技术实现植物育种获得新品种的一条快捷途径，既可以通过
花粉培养、未授粉子房以及胚株培养等诱导形成单倍体植物，也可以通过植物愈伤组织培养中普遍存在的染色体变异实现植物突变育种，另外，通过植物组织培养技术进行的植物细胞融合(尤其是原生质体融合)、胚胎培养以及植物体外受精技术可获得远缘杂交种，通过植物组织培养中的茎尖培养能够产生无病毒原种，因而可用于植物脱毒，解决生产实践中植物病毒危害问题，组织培养是植物细胞工程学、遗传学、植物生理学、生物化学与分子生物学研究的重要基础，不仅用于快速繁殖。还用于单倍体育种、种质保存、生理学研究和基因转化等领域。
早在上世纪80年代，高天舜就利用羊草根茎作为外植体进行愈伤组织的诱导和植株再生材料，目的是为了改良羊草的遗传性状，试图通过组织培养途径获得羊草新类型，该研究采用当年生羊草根茎幼嫩部分的节间基部切段以及隔年生老根茎和当年生根茎的芍间中部、顶部切段作为外植体，消毒处理后接种于3种MS培养基中，先进行暗培养。待长出愈伤组织后转入光照培养，诱导率平均在20％左右，分化率最高也只有24.2％，羊草幼穗和成熟种子也可作为诱导愈伤组织的外植体，刘公社等，以幼穗作为外植体，恒温25℃条件下诱导愈伤组织，在加有1mg/L2，4-D MS培养基上继代2次后，转移到含1.0mg/L KT和0.5mg/NAA的MS培养基上分化培养得到再生芽，并在无激素的基本培养基上获得了生根的试管苗，移栽到温室后可正常生长，尽管从羊草叶片、幼穗和成熟胚在同样培养条件下均能诱导出愈伤组织，但只有幼穗愈伤组织能够继续分化出再生植株，但分化率因基因型和外源激素的不同而不同，以成熟羊草种子为外植体诱导愈伤组织具有操作简便、污染程度低、材料选择直观化的优点，且诱导率和幼苗分化率较高、幼苗健壮、生长势好，崔秋华等采用3种培养基(MS、B5和8114)，3种2，4-D的浓度水平(1、2、4 mg/L)培养羊草幼嫩根茎和种子，结果表明，以种子作为外植体可获得较高的愈伤组织诱导率(29.05％)，但目前对于最适激素浓度没有统一结论，其范围从1～4mg/L不等，对愈伤组织的诱导效果也未达到令人满意的水平，仍需要深入研究。
在对羊草愈伤组织的应用方面，可以以羊草种子诱导出的愈伤组织为材料，用含有NaCl的培养基和含有NaHCO3与Na2CO3的混合盐培养基进行培养，测定羊草愈伤组织的耐盐性，结果表明羊草愈伤组织对NaCl最大耐受强度为180mmol/L；对NaHC03与Na2CO3的混合盐的最大耐受强度为4mmol/L中性盐(NaCl)与碱性盐(NaHCO3与Na2CO3)对羊草愈伤组织的胁迫机制明显不同，国内外对于愈伤组织的培养大多应用于转基因，但在羊草方面进行的该项研究却很少，刘公社将携带PAT基因的质粒通过基因枪法转化羊草愈伤组织。然后在筛选培养基上进行培养，筛选抗性愈伤组织并转接到分化培养基上，得到再生苗，然后接种到含有筛选剂的生根培养基上培养后得到转基因羊草小苗，该研究已获得耐除草剂的羊草新品种专利，曲同宝等用基因枪将BADH基因转入由羊草成熟胚诱导出的胚性愈伤组织中，获得了转基因植株，经过PCR检测证明外源基因已整合到羊草基因组中并得以表达，虽然转入羊草的基因都可被检测到已整合人羊草基因组中，而且也得到表达，但是对于转基因羊草对周围生态环境的影响还未见相关报道，筛选突变体是羊草愈伤组织的另一用途，陈晖等用组织培养方法筛选获得羊草抗羟脯氨酸(HYP)变异系HR20-8，该变异系细胞内游离氨基酸和蛋白质组分氨基酸含量均发生了较大的变化，与供体对照比较，分别提高2.35倍和1.40倍，其中，游离脯氨酸和蛋白质组分脯氨酸分别提高6.6倍和3.0倍，且脯氨酸合成途径必需的r-谷氨酸激酶的活性提高了2.5倍。
3 羊草酶蛋白类研究
蛋白质是生物体生命中的第一重要物质，是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现者，同时能够调控相关基因的表达，植物对抗非生物胁迫必然有蛋白质的参与，比如耐冷蛋白、热休克蛋白、水通道蛋白、赤霉素信号传导蛋白等，从羊草中检测这些蛋白的含量以及克隆表达该蛋白的基因对于研究羊草耐逆分子机理和改善羊草品质都具有重要意义。
目前对于羊草酶蛋白的研究还远远不够，主要有细胞色素氧化酶、过氧化物酶、脂酶同工酶等，其应用也仅局限于阐明羊草的遗传分化，通过聚类分析可以研究羊草种群在不同地理及生态环境中羊草在分子水平上细胞色素氧化酶同工酶存在着种内分化，羊草在同工酶水平上的分化受多个环境因子的综合影响，而且与羊草耐寒性能存在一定的内在联系，张丽萍等对采自同一天然草地上叶片呈黄绿色、灰绿色两种类型羊草的根、茎、叶的过氧化物同工酶、脂酶同工酶进行了分析比较，结果表明，两种叶色羊草，其相同组织的过氧化物同工酶谱及脂酶同工酶谱基本一致，两种羊草叶片呈现不同颜色只属不同生态型，
磁场处理不仅可以促进羊草的生长。而且还能提高羊草的抗盐碱性，磁场使羊草过氧化物酶(POD)活性提高，并且诱发了一条新的同工酶带，张卫东等认为羊草自交不孕的原因是自交不亲和。并利用禾本科植物自交不亲和性有关的硫氧还蛋白(thsioredoxin)^基因设计的引物在羊草DNA中检测到预期片段，说明硫氧还蛋白h基因可能与羊草的自交不亲和性有关，该基因现已被克隆并能够从GenBank中查到其序列。
研究羊草草原土壤酶的活性可以判断土壤的肥力，土壤肥力水平接近则土壤酶的活性相似，土壤蛋白酶、脲酶、多酚氧化酶的活性与土壤有机碳、全氮呈显著相关关系，可以反映土壤肥力水平高低，是评价土壤退化的重要指标。
4 羊草耐逆基因的分离与克隆
羊草具有耐寒、耐旱、耐盐碱的特性，并且蛋白质含量较高，说明羊草在面对非生物胁迫时高效表达能够适应、缓解或对抗相应逆境条件的物质，尤其是调控这些物质表达的酶类基因，据报道，羊草种子个体萌发期最大忍受pH范围是9.14-9.53，对于NaCl可耐受的最大强度为600mmol/L，对于Na2C03可耐受的最大强度为175mmol/L，为了弄清这种适应机制的复杂性，通过大规模的cDNA克隆或者表达序列标签(EST)的测序分离相关基因是非常重要的，Jin等采集自然生长的植物叶组织经过Na2CO3胁迫处理构建了cDNA文库，并对其EST进行测序对比分析，推断在羊草叶和根中各有39和31个非生物胁迫相关基因，这些EST资源将有助于对植物耐盐碱分子基础的深入研究和理解。
甜菜碱是在生物体内起着渗透保护作用最主要的细胞相溶性物质，编码决定该物质合成的关键酶一甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因已经先后从多种生物体内得到克隆，并在多种植物中进行了遗传转化。已获得了抗盐、抗寒、耐旱能力得到较大程度提高的转基因植株，某些植物体内的甜菜碱含量和BADH活性随着土壤盐碱化程度的加重而增加，因此推测甜菜碱可能与羊草耐盐碱性有关，目前羊草中的部分BADH基因片段也已经被成功克隆。
5 问题与展望
【关键词】龋病；牙菌斑；口腔细菌；代谢产碱
【中图分类号】R780.2
【文献标志码】A
牙菌斑生物膜是定植于牙表面的微生物群落，其与宿主防御之间存在着动态平衡，且与定植部位相适应。牙菌斑生物膜的细菌组成和代谢与龋病和牙周病关系密切。牙菌斑生物膜中糖源物质的摄入，致变异链球菌和乳杆菌等菌群产酸和耐酸菌并过度生长形成优势菌群，牙菌斑内pH迅速下降至临界值，从而引起牙齿脱矿。过去普遍认为，细菌产酸是龋病发生的直接原因。有学者认为，牙菌斑生物膜中耐酸菌比例的增加和口腔非耐酸性益生菌比例的减少是导致龋病的重要原因。当下的研究却发现，大部分的口腔益生菌都具有精氨酸脱亚氨酶系统（arginine deiminase system，ADS）或者尿素酶系统，可利用精氨酸或尿素为底物产碱，细菌代谢产碱可积极地调控牙齿脱矿与再矿化之间的平衡，阻止产酸和耐酸菌形成优势菌群，从而防止致龋性牙菌斑生物膜的形成。
研究显示，龋病与口腔微生物的产碱能力降低密切相关，调控牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱的能力可作为一种有潜在应用前景的防龋策略。随着细菌代谢产碱的能力与龋病呈负相关性的结论不断地得以证实，越来越多的研究者开始关注牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱的细菌学和分子生物学等基础和临床研究。本综述着重介绍口腔细菌代谢产碱的分子生物学研究进展，为未来的研究方向提供线索。
1 生物膜中细菌代谢产碱的主要途径
牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱最主要的两大途径包括尿素酶和ADS。尿素在健康人群口腔中的浓度为3～10mmol·L-1，主要来源于唾液和龈沟液。尿素在口腔中可以被细菌尿素酶迅速分解并产生氨、二氧化碳和水。具有尿素酶活性的细菌包括唾液链球菌和内氏放线菌以及口腔嗜血菌属等。相对于尿素，精氨酸在口腔中的平均浓度仅为50μmol·L-1。精氨酸可以被细菌ADS分解代谢为鸟氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。与尿素分解代谢不同的是，精氨酸代谢还为细菌提供了ATP，因此赋予了细菌额外的生长能量优势。多种口腔微生物均具有ADS，包括血链球菌、格氏链球菌和副血链球菌以及某些种类的乳杆菌属细菌和螺旋体。
精胺代谢是口腔中的另一条碱代谢途径。与尿素和精氨酸代谢相比较，精胺代谢酶活性较弱。精胺是精氨酸在细菌精氨酸脱羧酶作用下产生的中间代谢产物，也可来源于一些食物。精胺在牙菌斑生物膜和唾液中的浓度分别为0.75和0.2mol·L-1。精胺在细菌鲱精氨酸脱亚氨酶系统（agmatine deiminase system，AgDS）的作用下产生腐胺、氨、二氧化碳和ATP。该系统与ADS具有高度同源性。基因组分析和功能研究表明，AgDS存在于包括变异链球菌、表兄链球菌、汗毛链球菌、大鼠链球菌、链球菌、缓症链球菌和仓鼠链球菌以及唾液乳杆菌和短乳杆菌在内的众多口腔细菌中，其中大量的细菌与龋病密切相关。目前在所有具有AgDS的细菌中，仅大鼠链球菌、血链球菌和唾液链球菌等益生菌同时具有ADS和尿素酶系统。
2 生物膜中细菌代谢产碱与龋病的关系
有报道称，慢性肾功能衰竭患者唾液中的尿素水平较健康人高50倍，即使高糖饮食，其患龋率明显低于健康人群。Nascimento等发现：无龋人群的牙菌斑整体碱活性明显高于龋活跃人群；成年人非龋易患者唾液中的尿素酶活性是龋易患者的3～5倍，牙菌斑中的精氨酸脱亚氨酶活性是龋易患者的2倍。有报道称，儿童非龋易患者的牙菌斑尿素酶活性是龋易患者的2倍，唾液尿素酶活性是龋易患者的3倍，而且牙菌斑精氨酸活性是龋易患者的2倍。还有报道称，在牙膏或漱口液中加入精氨酸类化合物可降低人群的龋失补牙指数。上述研究均表明，牙菌斑生物膜中的细菌代谢产碱水平与龋病的发生呈负相关性。
3 生物膜中细菌代谢产碱的分子生物学研究
3.1尿素酶
口腔细菌代谢产碱途径的分子生物学研究最早开始于尿素酶，以前的综述中已经有详细的介绍。尿素酶是一种含镍的低聚物酶，编码尿素酶的7个基因排列成操纵子结构，ureC、A、B基因翻译产生α、β和γ三个亚基组成（αβγ）3结构，ureDEFG编码的辅助蛋白用于镍离子的整合和酶的激活。在有关口腔细菌尿素酶的研究中，唾液链球菌和内氏放线菌尿素酶的生物学特性及其基因表达调控的研究最为深入。这两种细菌的尿素酶有许多相似之处，均受多种环境因素的影响。以内氏放线菌为例，其尿素酶的活性在酸性环境下和有大量糖类物底物时增强，同时其酶活性也依赖于环境中氮源底物的量。值得注意的是，这些因素均与龋病密切相关；因此，Burne等提出当宿主处于患龋高风险时，唾液链球菌和内氏放线菌的尿素酶能够为防止龋病的发生发挥积极的作用。
3.2精氨酸脱亚氨酶系统
原核生物中广泛存在着ADS，该系统酶具有保守的一级结构。编码ADS的多个基因通常排列组成操纵子结构，但是其基因的排列顺序在不同的细菌间存在着差异。arcA基因负责编码精氨酸脱亚氨酶，这种酶可水解精氨酸生成瓜氨酸和氨。arcB基因编码一种分解代谢性鸟氨酸氨甲酰基转移酶，可将瓜氨酸转化为鸟氨酸和氨甲酰磷酸。位于arcB基因下游的arcC基因编码一种分解代谢性的氨甲酸酯激酶，后者可将氨甲酰磷酸的一个磷酸基团转移给腺苷二磷酸，从而生成ATP、二氧化碳和氨。此外，许多具有ADS的细菌，其操纵子中还存在一种编码精氨酸和鸟氨酸反向转运蛋白的arcD基因；精氨酸氨肽酶和相关转录调控子也是由ads基因簇中的基因编码。在具有ADS的细菌中，格氏链球菌是唯一由精氨酸脱亚氨酶arc操纵子与queA基因相连并共转录的细菌，这种基因被预测编码一种修饰tRNA的S－腺苷甲硫氨酸：tRNA核糖转移酶异构酶，后者与ADS转录调控子arcR共转录。
目前，已有众多关于口腔链球菌和非口腔细菌ads基因调控机制的研究报道。在口腔细菌中，ads基因的组成和调控研究主要集中在格氏链球菌、血链球菌和大鼠链球菌。虽然，ADS在不同细菌中的表达均受到多种环境因素的调控，如pH值、糖源、氧分压和精氨酸等，但是细菌间调控模式和机制却不完全相同。以格氏链球菌为例，其ADS主要受精氨酸和低pH值诱导，但是碳源性分解代谢物阻遏和高氧分压对精氨酸脱亚氨酶活性可产生抑制。这些环境因素对ADS的调控主要作用在转录水平，环境因素的调控作用主要通过多种调控蛋白质和多个双组分系统的交叉协同作用来实现。精氨酸对ADS arc基因转录的诱导作用主要通过ArcR进行调控；酸性环境诱导arc基因转录主要通过ArcR以及VicRK、CiaRH和ComDE的共同作用；碳源性分解代谢物对ADS的阻遏作用，则是通过宏观调控碳代谢蛋白质（carbon catabolite protein A，Ccp-A）实现的；高氧分压的环境信号则通过Fnr样蛋白Flp与双组分系统VicRK的协同作用，实现对精氨酸脱亚氨酶转录的抑制。此外，QueA对arc基因转录的影响整体表现为抑制作用，可能与影响了ads基因或其调控基因的转录效率有关。细菌间相互作用，如格氏链球菌在与内氏放线菌细胞共聚集的状态下，细菌内源性精氨酸的生物合成被激活，也可导致ADS的活性增强。
3.3鲱精氨酸脱亚氨酶系统
AgDS并非如ADS那样在微生物细胞中广泛存在。除部分口腔细菌以外，目前只在粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、希氏乳杆菌和幽门螺杆菌等少数几种细菌中发现了AgDS。与ADS一样，AgDS的基因也通常以aguBDAC操纵子的形式排列。精胺依靠一种精胺－腐胺反向转运蛋白D（agmatine-putrescine antiporter D，AguD）进入细胞，并在aguA基因编码的鲱精氨酸脱亚氨酶作用下水解为N－氨甲酰腐胺和氨，而N－氨甲酰腐胺又经aguB基因编码的腐胺氨甲酰基转移酶代谢生成腐胺和氨甲酰磷酸。最终，aguC基因编码的氨甲酸酯激酶将氨甲酰磷酸的一个磷酸基团转移给腺苷二磷酸，从而生成ATP、二氧化碳和氨。腐胺可以在反向转运蛋白作用下交换细胞外的精胺。agu基因的转录调控子由位于agu操纵子上游相反方向的aguR基因编码。
尽管AgDS的活性在口腔链球菌中存在着较大的差异，但其总体活性明显低于细菌ADS和尿素酶系统；尽管在变异链球菌和大鼠链球菌中检测到的AgDS与ADS的活性相似，但仓鼠链球菌和表兄链球菌AgDS却较其ADS的活性低50倍以上。在所有口腔细菌的AgDS活性当中，关于变异链球菌AgDS的研究最为深入细致，变异链球菌AgDS对细菌生长及耐受环境压力有着重要的意义。研究显示，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶缺陷株的生长速度明显慢于野生株。Burne等也曾报道，当变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶活性表达受到抑制时，其耐受酸、氧气和超氧化物的能力明显降低。
变异链球菌AgDS的活性表达受到细菌生长和多种环境因素的影响，其影响主要作用于细菌鲱精氨酸脱亚氨酶的转录水平。变异链球菌AgDS的表达同时依赖外源性底物精胺的供给。在仅有10mmol·L-1外源性精胺供给的情况下，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达可增高5倍。外环境pH值也是影响变异链球菌精胺脱亚氨酶表达的重要因素之一。刘娅玲等利用口腔恒化器模型研究发现，在pH5.5的酸性环境下，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达水平是pH7.0的中性环境下酶活性的3倍；同时，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达水平与细菌生长环境中的氧分压密不可分。氧气对变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达具有明显的抑制作用，当变异链球菌在无氧条件下培养时，其鲱精氨酸脱亚氨酶的表达是有氧培养条件下的3倍。
变异链球菌的AgDS活性依赖于细菌的生长周期，变异链球菌的AgDS在细菌对数生长早期表达较低；随着细菌进入对数生长中期，其酶活性表达逐渐增高；当细菌生长到达静止期时，其酶活性表达最高。此外，热刺激效应也可促进变异链球菌的AgDS活性表达。变异链球菌在44℃的条件下生长，其AgDS的活性表达是37℃条件下的2倍。变异链球菌AgDS的基因表达亦受到碳源性分解代谢产物的抑制。作为典型的抑制性糖源，葡萄糖对变异链球菌的AgDS具有较强的抑制作用；而当半乳糖作为糖源时，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的活性是葡萄糖作为糖源培养条件下的5倍。
在变异链球菌中，众多环境因素对AgDS的调节作用是通过多种调控通路的交叉以及多种调控蛋白质的交互作用来完成的。研究显示，AguR作为agu操纵子的主要调控蛋白质，参与低pH和底物精胺对AgDS的调控作用。刘娅玲等发现：AguR是一种位于变异链球菌细胞膜中的跨膜蛋白质，包括4个跨膜结构域，蛋白质C-末端可能位于细胞内；AguR蛋白在激活时会产生变构裂解，最终与agu操纵子结合启动agu的转录。除此之外，AguR调控蛋白与AguD精胺转运蛋白的相互作用是调控agu转录的关键。在低pH值和精胺存在的条件下，AguR调控蛋白可与AguD精胺转运蛋白发生交互作用，从而诱导AgDS的表达。AguR与精胺结合导致AguR的变构激活，从而促进AguR与其靶标agu操纵子结合。酸性环境有利于AguR形成合适的蛋白质构型，使其对靶DNA的信号转导更加高效。在缺乏外源性精胺的情况下，AguR与AguD的相互作用可能会阻止AguR与其底物或靶标的结合。该项研究结果对阐明AgDS的调节机制具有重要意义。除AguR和AguD以外，其他多种宏观调控蛋白和双组分系统也都同时参与了对变异链球菌AgDS的调控作用。CcpA和CcpB作为主要的碳源性分解代谢物阻遏调控蛋白，是不同碳源底物调节AgDS转录的主要调控蛋白。包括CiaRH、ComDE和VicRK在内的多个双组分系统都共同参与了低pH条件下AgDS的诱导，而且CiaRH同时也是变异链球菌感受外界热刺激效应下AgDS优化表达的重要调控因子。目前，虽然有研究例证实双组分系统之间存在交叉调控和串话现象，但外界环境信号是通过怎样的具体途径传导诱导AgDS表达仍需深入研究。
关键词：钾离子通道；结构；基因
离子通道(ion channe1)是跨膜蛋白，每个蛋白分子能以高达l08个／秒的速度进行离子的被动跨膜运输，离子在跨膜电化学势梯度的作用下进行的运输，不需要加入任何的自由能。一般来讲，离子通道具有两个显著特征：
一是离子通道是门控的，即离子通道的活性由通道开或关两种构象所调节，并通过开关应答相应的信号。根据门控机制，离子通道可分为电压门控、配体门控、压力激活离子通道。
二是通道对离子的选择性，离子通道对被转运离子的大小与电荷都有高度的选择性。根据通道可通过的不同离子，可将离子通道分为钾离子(potassium ion，k )通道、钠离子(natrium ion，na )通道、钙离子(calcium ion，ca2 )通道等。其中，k 通道是种类最多、家族最为多样化的离子通道，根据其对电势依赖性及离子流方向的不同，可把k 通道分为两类：①内向整流型k 通道(inward rectifier k channel；kin)，② 外向整流型k 通道(outward rectifier khannel；k out)。k 是植物细胞中含量最为丰富的阳离子，也是植物生长发育所必需的唯一的一价阳离子，它在植物生长发育过程中起着重要的作用，具有重要的生理功能。植物中可能存在k 通道，这一点早在20世纪6o年代植物营养学界就有人提出，而一直到80年代才被schroeder等人[23证实，他们利用膜片钳(patch chmp)技术，首先在蚕豆(v／c／afaba)的保卫细胞中检测出了k 通道钾离子通道的结构单个钾离子通道是同源四聚体，4个亚基(subunit)对称的围成一个传导离子的中央孔道(pore)，恰好让单个k 通过。对于不同的家族，4"亚基有不同数目的跨膜链(membrane。span。ning element)组成。两个跨膜链与它们之间的p回环(pore helix loop)是k 通道结构的标志2tm／p)，不同家族的k 通道都有这样一个结目前从植物体中发现的k 通道几乎全是电压门控型的，如保卫细胞中的k 外向整流通道等，其结构模型如图2一a所示。离子通透过程中离子的选择性主要发生在狭窄的选择性过滤器(selectivity filter)中(图2一b)，x射线晶体学显示选择性过滤器长1．2 nill，孔径约nill，k钾离子通道的作用.有关k 通道在植物体内的作用研究并不多。
从目前的结果来看，认为主要是与k 吸收和细胞中的信号传递(尤其是保卫细胞)有关。小麦根细胞中过极化激活的选择性内流k 通道的表观平衡常数km值为8．8 mmol／l，与通常的低亲和吸收系统km值相似[ 。近年来，大量k 通道基因的研究表明，k 通道是植物吸收转运钾离子的重要途径之一。保卫细胞中气孔的开闭与其液泡中的k 浓度有密切关系。质膜去极化激活的k 外向整流通道引起k 外流，胞质膨压降低，导致气孔的关闭。相反，质膜上h．atpase激活的超极化(hyperpolarization)促使内向整流钾离子通道(k in)的打开，引起k 的内流，最终导致气孔的张开钾离子通道相关基因及其功能特征迄今，已从多种植物或同种植物的不同组织器官中分离得到多种k 通道基因(图3)，根据对其结构功能和dna序列的分析，可以把它们分为5个大组：工，ⅱ，ⅳ组基因属于内向整流型通道；m组属于弱内向整流型通道(weakly inwardakt1arabidopsis k transporter 1)是第一个克隆到的植物k 通道基因，采用酵母双突变体互补法从拟南芥cdna文库中筛选出来cdna序列分析表明，akt1长2 649 bp，其中的阅读框为2 517 bp，编码838个氨基酸残基组成的多肽，相对分子质量约为95 400 da。akt1编码的k 通道，对k 有极高的选择性，其选择性依次是k >rb >>na >li 。
northern blot分析表明，akt1组织特异性较强，主要在根组织中表达zmk1(zea mays k channel 1)是从玉米胚芽鞘中分离出的k 通道基因，在皮层表达。在卵母细胞中的表达表明，zmk1编码的k 通道是通过外部酸化激活的。有研究表明，蓝光对zmk1通道在玉米胚芽鞘中的分布有一定影响[3 2l。1组kat1组基因编码内向整流钾离子通道，其与akt1组基因产物结构上的最大区别是在cooh端没有锚蛋白相关区(枷n—related do—main，anky)。kat1组基因主要包括kat1，kst1，sirk，kzm1，kpt1等。kat1(arabidopsis inward rectifier k channel1)是与akt1同时从拟南芥cdna文库中筛选出来的植物k 通道基因。kat1基因的阅读框含有2 031个核苷酸，编码的多肽由677个氨基酸残基组成，相分子质量约为78 000 da。kat1的表达具有组织特异性，kat1在拟南芥植株中的主要表达部位是保卫细胞，在根和茎中也有少量的表达。人们认为kat1通道可能参与了气孔开放，并向维管组织中转运k ，而不是直接从土壤中吸收kj。
以kat1为探针，又能从拟南芥cdna文库中筛选出kat2等功能类似的内向整流型k 通道基因通过基因工程技术，人们已相继开展了将kati和akti基因导人到拟南芥、烟草和水稻的研究，并获得了一些转基因植株。比如，施卫明等利用根癌农杆菌介导法已成功地把kat1和akt1导人拟南芥和野生型烟草中，并获得了转基因植株及其纯合株系，发现转基因植株的吸钾速率和对k 的累积能力都比对照的有明显的提高，而且，经过分子检测，也证实711和akt1基因在转基因植株中得到了整合和表达。因此，运用现代分子生物学手段和基因工程技术筛选高效利用钾的作物品种或利用现有的钾离子通道基因改良作物品种，从而提高作物本身的钾吸收利用能力应该是目前主要的研究方向。可以相信，随着分子生物学技术、基因工程技术和有关分析测试技术的发展和应用。随着研究工作的不断深入，有关钾离子通道基因的分离、克隆和利用会取得更大的进展。
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[文献标识码]A
[文章编号]1006-1959(2009)07-0280-02
肾细胞癌(renalcellcarcinoma,RCC)是泌尿系统常见的恶性肿瘤之一,长期危害着人类健康。近十年来,对肾细胞癌的分子生物学研究取得了长足的进展,使我们对肾细胞癌有了更深刻的认识。本文就肾细胞癌各种病理分型的分子生物学研究进展进行综述。
1肾细胞癌发生的分子生物机制
肾癌的发生发展是多阶段、多步骤的过程,包括癌基因激活和抑癌基因(tumorsuppressorgene,TSG)失活在内的一系列遗传学改变。抑癌基因的缺失或失活是肿瘤发生发展过程中重要的分子事件之一。肿瘤常在抑癌基因位点出现染色体基因缺失,表现为等位基因杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH),通过检测分析肿瘤LOH及其规律,可在染色体一定范围内发现肿瘤的抑癌基因及易感基因。为了能较全面的了解导致肾细胞癌发生发展的关键分子事件,不同学者对肾细胞癌全基因组进行了不同的研究,发现肾细胞癌发生高频率LOH主要见于以下几个染色体:3p、5q、8p、9p、10q、14q、17和18q染色体。
1.13号染色体:3号染色体短臂的部分缺失是肾癌基因改变中的高发事件。其中定位于3p25-26的VHL抑癌基因被认为是这些基因改变的首要目标。在以前的研究中,VHL在肾透明细胞癌(cc-RCC)中的失活机制主要为等位基因缺失和突变,DNA超甲基化很少见。刘宁等利用PCR限制性片段长度多态性法对3号染色体上的VHL基因的两个单核苷酸多态性位点进行检测来分析VHL基因的杂合性缺失失情况,发现,42%(8/19)发生VHL基因LOH,并未发现VHL基因失活与肿瘤的分期、分级存在联系。
有杂合性缺失研究显示,有可能在染色体3p上存在另外的RCC相关抑癌基因。定位于染色体3p14.2上包含最常见的FRA3B脆性位点的FHIT基因作为候选抑癌基因日益受到关注。Velickovic等通过选择性的检测FHIT区域的LOH发生情况认为这个基因在ccRCC的发展过程中起到很重要的作用。并且发现在cc-RCC中染色体3p的LOH发生率达76%。Farkas等对88例肾细胞癌病例进行LOH研究,选取了3p14.2-p25范围内16个位点采用PCR技术进行LOH分析,结果显示VHL基因和FHIT基因区域,透明细胞癌的LOH发生率高达96%,而状细胞癌和嫌色细胞癌仅为10%和18%,并且LOH的发生率与肿瘤大小、分期、分级无关。从而认为VHL和FHIT的等位基因缺失是肿瘤发生的早期事件。
1.25号染色体:1986年APC基因首次在一位患有息肉病及多种其它先天性畸形患者的5号染色体长臂片段先天性中间缺失中得到证实,确切的基因位点随后由定位克隆确定。Pecina-SlausN等利用相对外显子11和15的特殊寡核苷酸引物对36例肾细胞癌病例进行限制性片段长度多态性的检测,了解与APC基因相关的LOH情况,并同时检测APC蛋白的表达情况。研究发现36例样本中有33例为信息性病例,其中有17例出现LOH,并且LOH的发生与年龄以及肿瘤的TNM分期呈正相关。但并不是所有出现LOH的病例都有APC蛋白的表达。从而认为APC基因与肿瘤的进展有着密切关系,可能不是肿瘤发生的早期事件。
1.38号、9号染色体:Presti等学者对72例肾透明细胞癌进行LOH测定,并将LOH作为临床预后指标的评估,他们选取了3p,8p,9p,14q四个不同的染色体,在每个染色体上选取两对引物,结果显示8p、9p的LOH发生率与肿瘤复发率正相关。由此推测8p、9p的LOH可作为判断局部进展型肾癌预后的一个指标。
近年来许多学者在多种肿瘤,如肺癌、食管癌、黑色素、胃癌、成神经细胞瘤等研究中均发现,9号染色体常出现较高频率的LOH,所以推测9号染色体上存在不止一个与这些肿瘤的发生相关的抑癌基因。Fukunaqa等利用荧光多重PCR技术比较提取自肿瘤组织和对应的外周血液样本中的DNA,通过对9号染色体上的13个位点进行分析,发现109例肾细胞癌中27例至少有一个位点出现LOH,其中最高发生率出现在PTCH基因所在的9P22区域。而Sanz-casla等对40例单发肾细胞癌病例同时进行p16基因附近染色体9p21区域的LOH和p16基因启动子超甲基化的检测,出现LOH的为9例,超甲基化的为8例但是两者之间没有必然联系由此推测p16基因的失活和其他未知的抑癌基因共同参与肾细胞癌的发病机制。Grady则通过对60例肾细胞癌病例进行9号染色体上的16个微卫星位点的LOH分析,60例样本中至少一个位点出现LOH的为44例,主要缺失区域出现在位于9p21的DS171、D9S1749和DS270上。有46%的病例在9q32-9q33出现LOH,在这一区域的D9S170位点LOH发生率达22%,研究认为除了在9p21附近的p16候选抑癌基因外,在9p21以及9q32-9q33附近很有可能存在其它的抑癌基因。
1.410号染色体：Velickovic等对10号染色体上与PTEN/MMAC1抑癌基因相关的7个微卫星标记物LOH发生率进行分析，其中肾透明细胞癌的LOH发生率为37.5%，状细胞癌为29.7%，嫌色细胞癌为87.5%，且LOH发生率与肿瘤的分期、分级和生存率有关，并且认为双等位基因失活的发生多由非点突变畸变导致。
1.514号染色体：Kaku等对染色体14q24-31区域的7个微卫星位点进行研究，发现42例信息性病例中23例（54.8%)出现LOH，并发现LOH发生最普遍的区域位于D14S67附近的2-Mb范围，且LOH的发生率与肿瘤分期呈正相关。同样Alimov等利用2个RFLP位点对45例肾细胞癌患者进行研究，发现45例信息性病例中17例（38%）在染色体14q31-q32.2上出现LOH，并且LOH的发生率与肿瘤的分级和低生存率正相关。而Gallou等的实验则将14q上的普遍缺失区域定位于D14S281到D14S277之间。另外有学者对130例肾透明细胞癌病例采用D14S588、D14S617、GATA136B01三个位点进行LOH分析，数据显示LOH发生率与肿瘤大小、组织学分级、生长速度以及致死率呈正相关。
以上关于14q染色体的LOH研究均显示与肿瘤的分级和低生存率呈正相关关系，表明肿瘤的14qLOH很可能与肿瘤的侵袭发展有关。
1.617号染色体：p53基因位于17p13.1上，具有反式激活功能和广谱抑癌作用，与多种恶性肿瘤的发生、发展及预后有关。因此研究染色体17p上TP53位点的LOH情况对于揭示P53在肿瘤发生过程中发挥的作用意义重大。在29例肾细胞癌中，W.M.L.报道了关于P53的杂合性缺失为48%(14/29)，并通过序列测定确认单链构象多态性而发现了有11例出现突变。Ogawa等利用p53基因附近的5个多态性探针对48例肾癌进行研究，发现染色体17p的等位基因缺失率为17%(6/36)，并且染色体17p的等位基因缺失与肿瘤分期无确切相关性。其他研究者发现在17号染色体上还存在着其它LOH发生区域。Khoo等对BHD基因区域的2个微卫星位点D17S740和D17S2196进行检测，28例肾细胞癌中10例（36%）出现LOH，其中6例嫌色细胞癌中2例（33%）出现LOH，6例状细胞癌中出现5例（83%），透明细胞癌12例出现3例（25%）。并推测BHD基因可能在肾脏肿瘤的发生发展中起重要作用。而Simon-kayser等对处于17q11到17q23之间的7个微卫星标记物进行检测，15例状肾细胞癌中14例为信息性病例7例出现LOH。发生频率最高的为与FBXO47候选抑癌基因相关的D17s250位点。
1.718号染色体：Hirata等对126例肾透明细胞癌病例进行研究，通过对染色体18q上的9个微卫星位点实验，发现24例(19%)发生LOH，LOH最高发生率出现在DCC基因所在的18q21.3区域，并发现LOH的发生率与性别、肿瘤分期、分级、等参数无关。认为DCC和SMAD4可能做为候选抑癌基因与肾透明细胞癌的发生有关。 2肾细胞癌的病理分型与分子生物学机制
1997年国际抗癌联盟(UICC)和美国癌症联合委员会(AJCC)根据已知基因改变以及肿瘤细胞起源，并结合肿瘤细胞形态特点将肾癌分为透明细胞癌(clearcellrenalcellcarcinoma)、状肾细胞癌(papillaryrenalcellcarcinoma)、嫌色细胞癌(chromophoberenalcellcarcinoma)和集合管癌（carcinomaofthecollectingducts）4种基本形式。约有4％~5％肾癌细胞形态及遗传学改变不一，细胞成分混杂或有未识别的细胞成分，此类肿瘤归为未分类肾细胞癌（renalcellcarcinoma，unclassified），有待今后进一步研究。由于在各型肾癌组织中都可见到细胞质中含有嗜酸颗粒或梭形细胞成分，所以在新分类中取消了颗粒细胞癌和肉瘤样癌。
肾透明细胞癌或称为传统的肾细胞癌或非状肾癌，约占70％~80％，是最常见的病理类型，起源于肾近曲小管。已明确的遗传学改变是以3p缺失、VHL基因突变、甲基化或缺失为特征，此外尚有不十分明确的改变。综合国内外文献报道，常见的染色体缺失区域包括4q、6q、9p、13q、Xq、8p，常见的染色体扩增区域包括5q、9q、17p、17q。Jiang等利用分枝树模型及时间树模型对肾癌比较基因组杂交数据进行分析后认为透明细胞癌至少可能分为两个亚型，一型伴有-6、+17p、+17q，另一型伴有-9p、-13q、-18q。-4q是透明细胞癌发展过程中除-3p外的另一重要早期事件，-8q多出现在转移灶中，是原发性透明细胞癌的一个晚期事件，9p、13q上可能存在与肾癌进展相关的抑癌基因。
状肾细胞癌或称为嗜色肾细胞癌或肾小管状癌，约占10％一15％，是第二常见的肾恶性肿瘤，可能起源于肾近曲小管。遗传学上，以Y染色体丢失、7号染色体和17号染色体的三倍体或四倍体异常为特征，此外较典型的分子遗传学异常尚有C-MET基因活化、+12q、+16q、+20q、-1P、-4q、-6q、-9p、-13q、-xp、-xq、-Y等。Delahunt和Eble在1997年应用免疫组化方法分析91例状肾细胞癌，根据形态学改变分为2型，1型状肾细胞癌光学显微镜下呈管状结构，被覆小细胞，含有卵圆形小细胞核，核仁不显著，胞质少、灰白。2型状肾细胞癌为状结构，被覆丰富嗜酸性胞质的大细胞，含有大球形细胞核。分析结果显示：7号染色体和17号染色体倍体异常多见于状肾细胞癌1型，而-Xp常提示预后不良。与透明细胞癌相比，状肾细胞癌的多灶性或双肾癌更常见。
嫌色细胞肾细胞癌约占5％，起源于肾集合小管暗细胞。遗传学以多个染色体丢失和单倍体为特征，LOH常发生在1、2、6、10、13、17或21号染色体。
肾集合管癌少见，起源于肾髓质或肾的中央区集合管上皮，遗传学上的改变无统一形式，以染色体18、21和Y染色体单体丢失以及染色体7、12、17、20的多倍体异常较常见。
[关键词] 早期宫颈癌；复发；分子生物学
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-39-03
宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。宫颈癌死亡率每年大约26万，其中80%发生在发展中国家，HPV16和18是最常见的两种致宫颈癌的病毒，70%的宫颈癌由这两种病毒引起[1]。近年来采用阴道脱落细胞图片检查的普及，使不少宫颈癌患者能早期发现、早期治疗，提高了患者的生存期。但临床发现宫颈癌年轻化倾向明显，25～54岁人群发病率不降反升[2]。导致早期宫颈癌复发的因素较多，许多国内外学者对早期宫颈癌的各方面进行了大量的研究分析，得出了很多与早期宫颈癌复发有关的原因。本资料通过对国内外最近五年相关文献资料的研究学习，总结导致早期宫颈癌复发的分子生物学因素。
1 宫颈上皮细胞间质转化
大量的研究表明宫颈上皮细胞间质转化（EMT）与宫颈癌的形成和转移复发有密切关系。
1.1 上皮细胞间质转化（EMT）
正常的上皮细胞靠专门的细胞间粘附力紧密连接在一起，而且具有顶-基底极性。间质细胞形似纺锤体，连接松散，流动性强，具有前-后极性。上皮细胞通过复杂的程序转变成间质细胞的过程称为上皮细胞间质转化。上皮细胞转变为间质细胞后会失去原来的特性，中间会形成一种亚稳定的细胞既有上皮细胞又有间质细胞的特性，这是一种很多肿瘤都有的过程[3]。上皮细胞间质转化有3种类型，其中第3型存在于肿瘤的侵袭与转移中[4]。宫颈上皮细胞通过EMT过程，形成上皮样的癌细胞失去极性，不稳定，但是还具有上皮细胞的其他特性，经恶化和分化形成具有转移、侵袭能力的癌细胞。癌细胞离开原始位置，侵入基底膜下，侵入血管和淋巴管随血液转移到另一个地方形成转移灶。在这过程中，还有以下因素参与，干细胞机制[5]、抗吞噬作用[6]、免疫逃避、药物抗性等。
1.2 EMT的分子生物学
上皮细胞间质转化的标志性分子变化主要有：（1）E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的下调。E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的下调与早期宫颈癌的组织学分化、转移和复发成正相关[7]。（2）N-钙粘着糖蛋白、纤维连接蛋白以及波形蛋白的上调表达。波形蛋白的上调表达与早期宫颈癌的转移、复发成正相关[7]。（3）Rho GTP酶介导的细胞骨架重排。RhoC在正常宫颈组织、CIN 组织和宫颈癌组织中的表达逐渐增高，在有淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达明显高于无淋巴结转移组织，同时RhoC的沉默可以明显降低SiHa细胞的体外粘附能力和侵袭、迁移能力[8]。（4）调控EMT的基因转录因子的上调和易位，如Twist1、Twist2、Snail、Slug、Six1等。Twist1、Twist2和E47抑制E-钙粘蛋白的表达以及调节其它基因功能诱导EMT过程[9]。
1.3 EMT的信号通路
上皮间质转化的信号通路有转化生长因子（TGF-β）通路、Wnt通路、Notch通路、NF-κβ通路等。这些通路相互作用，共同调节EMT的过程[10]。
1.3.1 TGF-β信号通路 TGF-β是一组具有广泛生物活性的多肽，哺乳动物中有三种亚型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是TGF-β相关的致瘤作用研究的重点，TGF-β1在肿瘤细胞中是上调的[11]。TGF-β通过细胞膜表面具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TβR Ⅰ和TβR Ⅱ结合形成复合物。TβR Ⅰ有ALK1/TSR-1、ALK1/TSK7L、ALK5/TβRⅠ 3种受体，TβR Ⅱ只有一种受体。TGF-β与TβR Ⅱ结合形成复合物使TβR Ⅰ磷酸化，随之smads被磷酸化，诱导该复合物进入细胞核；这一信号通路受到干扰发生异常，与肿瘤的发生有重要关系[12]。与TGF-β信号通路影响细胞核内转录的因子有smad、Ras、Rho、TAK1、PP2A、β-catenin 以及NF-κβ、ATF2等。Smad7和TGF-β1与宫颈癌的发生发展、临床分期、侵润和淋巴结转移相关[13]。Stephanie等[14]的研究发现TGF-β信号通路在EMT过程中起着重要作用，从而导致癌细胞具有侵袭和转移能力。Iancu等[15]研究TGF-β通路在HPV诱导的宫颈癌中发现TGF-β通路的破坏与宫颈恶性进展有很大关系；在宫颈上皮样瘤变到宫颈癌的过程中TGF-β1表达减少；同时TGF-β1受体基因表达也下降。
1.3.2 Wnt信号通路 Wnt信号通路有经典的Wnt信号通路、Wnt/ca+通路、Wnt/PCP通路，其中经典通路最重要，通过β-catenin激活基因转录；其机理概括为WntFzdDshβ-catenin降解复合体解聚β-catenin入核TCF/LEF基因转录[16]。参与Wnt信号通路的蛋白有Frizzled、Dishevelled、Gsk3β、CK1、APC、β-catenin等。Wnt信号通路受到刺激后，APC基因突变使β-catenin降解复合物合成障碍，以及β-catenin基因突变使β-catenin不能被磷酸化和泛素化降解，从而使β-catenin降解障碍，胞浆内游离的β-catenin聚集，进入核内激活Cyclin D1、C-myc等基因转录，导致肿瘤发生。细胞核的Survivin、Cyclin D1受Wnt通路的激活[17]，影响宫颈癌的复发和转移。Survivin、P21、Cyclin D1蛋白对早期宫颈癌复发的影响中发现，三者在早期宫颈癌中的表达明显升高，并且三者共表达时与临床分期、病理分级有关；Survivin、Cyclin D1表达与早期宫颈癌复发有关，二者共同表达与盆腔淋巴结转移有关[18]。
1.3.3 Notch信号通路 Notch信号通路是肿瘤血管生成和转移的一个关键因素[19]。Notch信号通路由Notch、Notch配体（Jagged）、受体等组成，其中配体有Delta-like1、3、4，Jagged1、2，CSL，受体有Notch1、2、3、4，Notch信号通路在不同的肿瘤以及不同的阶段作用不同。Notch信号通路概括为DeltaNotch酶切ICN细胞核CLS/ICN复合体基因转录[19]。Notch1中有Notch1-RBP-Jκ路径、Notch1-PI3K-PKB-Akt路径、Notch1-IKK-NF-κB路径共同相互影响宫颈癌的发生发展[20]。Bajaj等[21]研究发现CD66+细胞中Notch信号通路对宫颈癌有重要作用。免疫组织化学分析显示Notch3在宫颈鳞癌中过度表达，Notch阳性表达的宫颈癌患者比阴性表达的患者的生存率小[22]。
1.3.4 NF-κB信号通路 基本的NF-κB信号通路包括受体、受体近端信号衔接蛋白、IκB 激酶复合物、IκB 蛋白和NF-κB二聚体。受到刺激后IκB 激酶复合物被激活，IκB 蛋白磷酸化和泛素化，IκB 蛋白被降解，NF-κB二聚体释放修饰后进入细胞核内，进行基因转录。NF-κB一般情况下位于细胞胞浆内，由两个功能亚单位P65和P50组成，与其抑制因子IκB-α和IκKB-β结合在一起。宫颈癌中IκB-α的去磷酸化使IκB-α减少，从而NF-κB的P65进入细胞核内[23]，参与细胞核内基因的表达调控。NF-κB激活对肿瘤的促进作用主要有：（1）①NF-κB激活对宫颈癌的转移有明显促进作用[24]；（2）NF-κB的GADD45α和γ表达下调使肿瘤细胞逃避凋亡；（3）NF-κB上调Cyclin D1等，促进肿瘤细胞生长。NF-κB的P65和c-IAP2的过度表达和caspase-3的下调，是宫颈癌发生发展的重要因素[24]。
2 小结
目前国内外对早期宫颈癌治疗后复发的因素研究较多，都认为复发是由于多方面、多路径的因素共同作用的结果。发现复发转移的关键因素，提高患者的生存率，减轻患者的痛苦是有必要的。除EMT、VEGF信号通路、notch信号通路等，是否可以发现更多关键的分子生物学层面的相关因素，使早期宫颈癌能更早的发现，得到早期治疗，阻断关键的分子生物路径，减少复发率。
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迄今为止已发现和胆道肿瘤有关的癌基因有Ras（K－ras，N－ras）、c－myc、c－erbB－2、某些细胞因子及其受体、抗癌基因有P53、P16／MTS1、APC、DCC等。
1 癌基因
ras基因是一个常见的癌基因家族，由K－ras，N－ras，和H－ras三个成员构成［1］。细胞中正常ras基因编码高度相关的分子量为21000的蛋白质（P21）。P21是一种鸟嘌呤核苷酸（GTP）结合蛋白，它由188或189个氨基酸组成，和细胞生长和分化密切相关。正常P21和GTP结合后激活磷脂酶C，产生第二信使三磷酸肌醇（IP3）和二酰甘油（DG），之后GTP被P21降解，第二信使便执行使细胞分化和生长功能。若正常的ras基因发生了突变而变成了癌基因，其所编码的变异P21蛋白仍能同GTP结合但是失去了降解GTP的功能，从而使磷酸脂酶C持续活化，产生大量IP3和DG，引细胞过度增殖，最终发生癌变［1］。
现在已在人类多种肿瘤中检测到了ras基因突变［1］。40％的结肠癌，50％的肺腺癌，30％的急性白血病中均可检测到ras基因的突变。其突变的作者单位：中国医科大学第二临床学院肝胆外科（沈阳110003）崔健现在上海医科大学中山医院肝癌研究所（200032）主要方式是点突变，12、13、61密码子是突变热点。在胰腺癌中K－ras基因的突变率高达90％以上，而且突变的位点大多局限于K－ras基因12位点上［2］。但是对于胆系肿瘤，关于ras基因突变研究文献极少，而且结果差异很大，甚至还有完全相反的报道［3～5］。
almoguera应用RNA酶错配切割法和DNA直接测序，分析胆道肿瘤的病理标本时，未见任何ras基因改变［2］。而Tada等应用DNA测序法研究胆囊癌和胆管癌标本发现肝外胆管癌中偶有ras基因突变，在胆囊癌中则不存在ras基因改变［3］。与之相反，Levi等的研究结果表明胆系肿瘤中存在着广泛ras基因点突变［4］。他们认为以往文献所报道的胆系恶性肿瘤中K－ras基因低突变率的原因不在于肿瘤细胞中真的不存在K－ras基因改变，而是检测方法灵敏度不够所致。DNA直接测序时，大约需要20％的细胞发生突变才能得到阳性结果，而RNA酶寡核苷酸错配切割法的灵敏度则更低。他们认为，由于胆道肿瘤是多克隆发病，因而发生K－ras基因突变的细胞只是一小部分，用常规的实验方法难以检测出来。他们应用改良的两步PCR－RFLP法（两轮碱基错配PCR＋两轮限制性核酸内切酶酶切）配以DNA直接测序，发现肝外胆管癌中K－ras基因突变率为100％。这种方法灵敏度非常高，可以在512个等位基因中检测到一个基因的点突变。
watanabe等应用与Levi类似但更为简便的方法检测了20例胆道肿瘤的标本［5］。结果发现55％的胆囊癌、100％的肝外胆管癌均存在K－ras基因改变。总的突变率为75％。绝大多数突变发生在第12位密码子。常见的突变方式是GA，使GGT变成了GAT，所编码的氨基酸也随之由甘氨酸变成了天冬氨酸。少部分发生GGTGTT及GGTTTT改变，这些都导致了相应氨基酸改变，因而均是有意义突变。更为重要的是，他们发现一例胆囊腺瘤癌变的标本中，表面正常的腺瘤已经发生了K－ras基因突变，而且突变方式和癌组织完全一样，从而在基因水平上支持了胆囊腺瘤癌变的理论。
ajiki等的研究亦表明K－ras基因突变是胆道肿瘤中的一种普遍现象［6］。在他们的研究中，胆囊癌、胆管癌、胆囊上皮不典型增生的K－ras基因12位点的点突变率分别为57％、59％、73％。他们的实验也发现了一个很有意义的现象：9例发生在胆囊癌周围的不典型增生，都表现出了和胆囊癌相同的突变。因此他们认为在某些致癌因素（如：胆石、长期胆汁酸刺激等）的作用下，胆囊粘膜肠上皮化生胆囊粘膜不典型增生胆囊癌是胆囊癌的发病机制之一。
yukama 等应用免疫组织化学方法研究了慢性胆囊炎、早期胆囊癌和进展期胆囊癌中ras基因和其他癌基因产物的表达。发现早期胆囊癌中ras基因产物P21阳性表达率高达95％。胆囊炎为33％。其他癌基因产物如c－myc、c－erbB2、表皮生长因子（EGF）、转化生长因子受体（TGF－β）等在胆囊癌都有高表达，平均阳性率在60％左右。而在慢性胆囊炎中它们表达阳性率较低，平均在10％以下［7］。Lee等的研究结果也表明，与胆囊不典型增生和慢性胆囊炎相比，胆囊癌中P21呈现强表达，阳性率为62％，胆管癌中P21阳性率也达到了50％。P21表达和预后没有明显的关系［8］。以上学者都认为：胆囊癌发病过程中存在着多种基因共同作用，其中，ras基因突变可能是早期发生的事件之一。这与ras基因突变在结肠癌发病中的作用是类似的［9］。
c－erbB2癌基因所编码产物是一种表皮生长因子受体（EGFR）类似物。对于它的研究结果不尽相同。Kamel等的研究结果表明胆囊癌中c－erbB2·35·肝胆胰外科杂志1999年第11卷第1期阳性率大约为10％。胆囊粘膜不典型增生中，其阳性率为0。他们认为c－erbB2表达在胆囊癌中是一较晚事件，只有在细胞癌变后才出现［10］。而Yukama等的研究表明c－erbB2在早期胆囊癌中阳性表达率为69％。在进展期胆囊癌中表达率为0。他们认为c－erbB2癌基因突变是胆囊癌发生早期事件之一［7］。出现这一不同结果的原因可能是：1．他们采用的方法、技术和对阳性率的规定不同。2．所选择的胆囊癌是由完全两种不同的致癌因素造成的。因此关于c－erbB2在胆囊癌发生中到底起何种作用，仍需进一步研究。
2 抑癌基因
关于抑癌基因，目前研究最多的是P53基因。P53定位于人染色体17P13，全长为16－20Kb，由11个外显子构成。正常P53基因编码野生型P53蛋白，是一种分子量为53KD的核内磷蛋白。人的P53蛋白由393个氨基酸组成。P53基因突变后所编码的蛋白称为变异型P53。
在人乳腺癌、脑瘤、结直肠癌、食管癌和肺癌中均已发现P53基因突变，总突变率为50％左右［11～13］。其中83％为错义点突变，6％为无义点突变，10％为插入或缺失突变。P53的突变并非随机发生，大多数的突变发生于133－299氨基酸。应用PCR技术研究后发现密码子132－145、171－179、239－248、272－286为突变热点。
野生型P53蛋白的主要功能是：抗细胞增殖，抑制细胞生长分裂，使细胞停止于G1期而不进入S期。野生型P53可以阻碍DNA复制起始复合物的装配，抑制DNA复制，并且在转录水平进行调节，防止细胞过度生长分裂。此外野生P53蛋白还可以诱导细胞分化。野生型P53基因失活的细胞经久处于未成熟状态，持续增生。突变型P53则不具备以上的功能。
野生型P53蛋白极不稳定，半衰期很短，而突变型P53则很稳定，可以在核内积聚，这使得可以用免疫组织化学方法检测到它的存在［14］。突变型P53的检测可以很好反映P53基因突变情况［15］。这一点不同于Ras基因。Wee等用S－P法研究了胆囊癌和肝外胆管癌中P53蛋白表达，阳性率分别为73％和64％［16］。他们认为在胆道癌发病过程中，P53基因突变是一个普遍发生的事件，是胆道癌发生内在因素之一。Kamel［10］等的研究结果也表明在胆道癌中普遍存在着P53基因突变。更为重要的是，在两例胆囊上皮不典型增生的标本中，他们也发现了P53蛋白阳性表达。
hanada等研究发现，在病理类型为平坦型的胆囊癌中，P53阳性率高于息肉型胆囊癌。而平坦型癌多为浸润癌［17］。Roa的研究也表明，在早期胆囊癌中，P53的阳性率为23．5％，在进展期胆囊癌中，P53的阳性率达到48．2％。在高分化胆囊癌中，P53的阳性率为25％，而在低分化的胆囊癌中，P53的阳性率达到50％［18］。以上研究均提示P53高表达是肿瘤分化低、处于进展期、预后不佳的标志。
p16是近年发现的比P53更有力地引起正常细胞癌变的肿瘤抑制基因，又称为多肿瘤抑制基因（MTS1）。P16基因定位于人染色体9P21，由三个外显子构成。总长度为8．5Kb。其编码产物P16蛋白是细胞增殖周期的重要调节者和控制者［19］。它是细胞周期依赖性激酶4（CDK4）抑制因子。因而又称M TS1／P16／CDK4。细胞进入分裂周期依赖于周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的活化，CDK4和D型周期蛋白结合形成复合物能促进细胞从G1S期的转变，从而促进细胞增生，这可能是恶性肿瘤发生因素之一。P16蛋白能和CDK4结合，抑制细胞转化。近年来有关P16基因纯合性丢失的研究表明，在人类大部分肿瘤中，均有P16纯合性丢失，与杂合性丢失一起，总的突变率为50％。碱基突变和缺失另占25％，故在肿瘤组织中P16总突变率为75％，比P53的50％的突变率高得多。
1995年，Yoshida等人世界上首次报告了P16基因在胆道肿瘤中的突变情况［20］。他们分析了25例胆道肿瘤标本和4个胆系肿瘤细胞株后发现原发胆道肿瘤中P16／MTS1的总突变率为64％（其中胆囊癌80％，胆管癌63％），高于P53突变率。他们认为在胆系肿瘤发生中，P16可能比P53起更重要的作用。但是P16在胆系肿瘤中到底作用如何，具体突变方式如何，因目前研究太少，尚不能得出一个明确结论。
aPC基因和DCC基因是通过对大肠癌研究在人5号染色体上克隆的抑癌基因，前者位于5q21，编码产物分子量超过300，000，调控ras基因表达。后者也位于5q21，在APC附近。关于他们在胆道肿瘤的研究较少。虽然已在2个人类胆管癌细胞株中发现有5号染色体改变［21］，但应用多种基因探针杂交未发现在肝内胆管癌中有5q［21，22］缺失，故认为APC和DCC与胆管癌关系不大［22］。
3 前景和展望
虽然对于胆系肿瘤的分子生物学研究与胃癌、结直肠癌和胰腺癌相比仍不够深入，众多的问题还有待于解决，但是目前的研究结果大大丰富了我们对于胆系肿瘤的认识，这对于寻找早期诊断胆系肿瘤的有效手段具有重要的指导价值。
胆道肿瘤发病率近年明显上升。由于早期诊断困难，故预后极差。寻找一条有效的早期诊断手段是当前研究的重要课题。从胰腺癌的研究中我们可以获得一些启发。1990年Shibata对36例胰腺癌标本作细胞学检查的同时作K－ras基因突变分析，结果25例细胞学检查恶性标本中18例测到了ras基因点突变［23］。3例细胞学检查良性标本无一例发生ras基因突变。8例细胞学检查为不典型增生标本中，有两例发生突变。1991年，Tada等对B超引导下胰腺穿刺所获得的细胞进行基因分析，检测K－ras基因12位点的突变，成功地为2例细胞学检查无法判定病变良恶性的病例作出了诊断［24］。随着研究方法的不断改进，特别是改良的二步PCR－RFLP方法的应用，人们发现胆道肿瘤中也广泛存在着K－ras基因12位点的突变，总突变率在75％～100％之间，接近于胰腺癌突变水平。由于PCR技术灵敏性和特异性极高，可以从几个拷贝的DNA分子中检测到K－ras基因点突变，因而用十二指肠引流或PTCD检查获得胆汁中的脱落细胞，或在B超引导下用细针穿刺胆道肿瘤获得标本，然后用PCR法检测标本中K－ras基因12位点突变，有可能开创一条早期诊断胆道肿瘤的新途径，而且对于常规影像学和细胞学检查有重要补充价值。
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关键词：猪传染性胃肠炎；病毒分子；生物学检测方法
中图分类号 S858.28 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）12- 0110-02
猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）导致猪出现脱水、水样腹泻以及呕吐等为主要临床症状的高度传染性疾病，该病在春季、初秋以及冬季具有较高的发病率[1]。猪传染性胃肠炎最早发生于美国，随后在世界各地均有发生，我国于20世纪50年代首次发现该病，目前全国大部分地区均发生过猪传染性胃肠炎。不同日龄和品种的猪均可以感染传染性胃肠炎，其中以15日龄左右的仔猪发病后死亡率最高，高达100%；5周龄以上的仔猪感染传染性胃肠炎后死亡率较低，但是会影响仔猪后期的生长，降低仔猪的饲料利用率。目前，该病已被世界动物卫生组织列为B类必检传染性疾病。近年来，随着分子生物学技术的不断发展，该技术已经广泛用于各种细菌性和病毒性疾病的检测[2]。本文综述了分子生物学技术在传染性胃肠炎中的应用，以期能为从事传染性胃肠炎诊断和防控的工作者提供帮助。
1 传染性胃肠炎病毒基因组结构和基因表达方式
1.1 TGEV基因组结构 传染性胃肠炎病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，该病毒的基因组不分节段、单股正股RNA，具有高度传染性。传染性胃肠炎基因组全序列分为7个区29kb，结构序列为5'-la-lb-S-3a-3b-sM-M-N-7-3'，并且该基因组的3'-末端以共价键结合的poly结构，5'末端有帽结构[3]。基因组1约有20kb，主要负责病毒的编码，其余基因均在近3'端。传染性胃肠炎病毒全基因组编码由4种结构蛋白和3种非结构蛋白组成，其中基因7、基因3和基因1为非结构蛋白，N、M、sM、S为传染性胃肠炎的结构蛋白。
1.2 基因表达方式 传染性胃肠炎病毒在胞浆脱壳以后，其正链RNA就呈现了mRNA的功能，使基因1转录表达RNA聚合酶，同时该基因有作为模板合成负链RNA，进而亲代RNA与负链RNA形成双链复制中间体。因此，在感染传染性胃肠炎病毒的细胞内，可以检测出不完全RNA、基因组RNA、mRNA以及双链中间体4个特异性RNA，这可以作为猪传染性胃肠炎病毒分子生物学检测指标之一[4]。
2 结构蛋白及功能
猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白主要为S糖蛋白、M蛋白、N蛋白以及sM蛋白等。S蛋白是猪传染性胃肠炎病毒纤突的主要成分之一，在病毒粒子的表面，该蛋白基因全长4.3kb，蛋白分子量为195～220ku；S蛋白不仅是决定猪传染性胃肠炎病毒抗原的重要结构，也影响着病毒对细胞的致病性、亲嗜性等。M蛋白是构成病毒粒子蛋白的主要有效成分之一，研究表明[5]，M蛋白前体是由膜外区、信号肽、极性区、跨膜区突于病毒粒子内C-端区等功能区域构成，分子质量为29～31ku；M蛋白不仅决定了病毒粒子的出芽位点和装配位点，也可以影响病毒变异。N蛋白是一种酸性蛋白质，分子量为47KDa，含有382个氨基酸残基，该蛋白不仅是猪传染性胃肠炎病毒的结构蛋白，同时对病毒基因组的加工、复制都具有重要作用。sM蛋白分子质量为78ku，含有1种小膜蛋白和82个氨基酸残基，该功能蛋白在抗猪传染性胃肠炎病毒感染的体液和细胞免疫中具有重要作用。
3 分子生物学检测方法
3.1 核酸探针 核酸探针检测方法的基本原理是利用核苷酸碱基互补，在碱基互补过程中，采用标记物标记与被检测靶序列互补的单链核酸分子，进而检测到目的核序列。该检测方法与扫描电镜、荧光抗体试验、病毒分离等相比，具有较好的特异性，并且可以实现快速检测的目的。现代研究表明[6]，不同的病毒探针可以分别扩增出与其对应的病毒模板，对其他病毒模板影响不大，同时核酸探针扩增的最低检测限为3 000～6 000个拷贝的单个病毒核酸，具有较高的特异性和敏感性。
3.2 普通RT-PCR方法 该检测方法使用的首要条件是知道被检测病原的相关目的基因序列，根据相关目的序列后，采用相关软件设计相应的引物，然后进行体外扩增目的基因，进而达到检测的目的。王黎等[7]采用RT-PCR方法检测猪传染性胃肠炎病毒，并采用相同浓度做重复性检测，结果显示RT-PCR扩增的特异性条带为590bp左右；然后又以猪瘟病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒、猪伪狂犬病病毒以及猪轮状病毒做特异性试验，结果显示仅有猪传染性胃肠炎病毒得到了特异性目的条带，所以RT-PCR检测方法对猪传染性胃肠炎病毒检测具有较好的重复性和特异性。
3.3 多重RT-PCR方法 多重RT-PCR检测方法是以普通PCR为基础发展的一种新型检测方法，该检测方法可以在一个PCR反应体系中加入多对引物，并通过采用优化后的PCR反应条件，达到同时检测多种病原的目的，具有快速、成本低等优点，目前也常用于各种疾病的诊断。霍金耀等[8]建立了多重RT-PCR法检测传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、嵴病毒和A群轮状病毒的方法，并对该检测方法进行了敏感性试验和特异性试验，结果显示，多重RT-PCR法可以检测出50TCID50的混合病毒，且能扩增出长度为275bp、544bp、750bp的3条特异性片段，具有较高的特异性和敏感性，可以在临床上推广使用。
3.4 套式PCR方法 套式PCR方法需要设计内、外2对引物，并通过2次扩增对样品进行检测，该方法相对其他PCR检测方法，具有较高的敏感性，且节约成本。现代研究表明，PCR技术在检测病毒时，可以省略不同病毒分离的过程，具有较高的敏感性和特异性，而套式PCR方法在病毒粒子较少的情况下依然能够检测出，表明套式PCR比常规PCR具有更好的敏感性。沈海娥等[9]采用套式PCR检测猪呼吸道冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒的S基因序列，根据两组病毒的基因序列分别设计了2对引物，然后分别以猪呼吸道冠状病毒细胞和猪传染性胃肠炎病毒细胞为模板进行套式PCR特异性片段扩增，结果显示，猪呼吸道冠状病毒扩增的基因片段为214bp，猪传染性胃肠炎病毒扩增的基因片段为886bp，同时检测出了这种病毒，具有较高的特异性和敏感性。
3.5 荧光定量RT-PCR方法 荧光定量RT-PCR检测方法的原理是在PCR反应体系中采用荧光探针标记法或加入了SYBR GreenI荧光染料标记PCR的反应产物，然后使用反应仪器收集反应产物的荧光信号，并根据荧光信号的强弱确定产物的量，进而达到与起始模板准确定量的目的。该检测方法与常规RT-PCR相比，不需要进行电泳试验检测PCR反应产物，反应结果更为直观、方便，同时又避免了因电泳试验对环境造成污染。王建中等[10]根据猪传染性胃肠炎病病毒的S基因序列设计了引物，并通过多组试验对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化，结果显示，优化后的检测方法对其他病原的检测结果均为阴性，检测结果的敏感性高达43.07拷贝/μL，是常规PCR检测方法的100倍，具有较高的敏感性和特异性。
3.6 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是近几年新兴的一种分子生物学检测方法，因其具有特异性强、敏感性高、检测速度以及操作简单等优点，目前已经广泛应用于病毒病和细菌病检测。高睿泽等[11]根据猪传染性胃肠炎病毒的N基因建立了环介导等温扩增快速检测方法，并对该检测方法的敏感性和特异性进行了评价，结果显示，该方法在63℃下可以使猪传染性胃肠炎病毒N基因获得较高的特异性扩增，且与猪流行性腹泻病毒等物交叉反应，具有加高的特异性；同时该检测方法可以检测到131.4fg/μL的DNA，其灵敏度比常规PCR高出3个数量级。
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【关键词】 中药； 多药耐药； 分子生物学
目前，化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而在化疗过程中易产生肿瘤的多药耐药，大大降低了其疗效。因此，如何解决多药耐药就成为了提高化疗疗效，改善患者生活质量的关键问题。多药耐药(multidrug resistance，MDR)是一个多基因参与的过程，涉及多种耐药相关蛋白［1］。不同肿瘤具有不同的耐药表型，可以是某种耐药基因表达，也可能是多种耐药基因同时表达的结果，而由于中药的多靶点作用，其可通过作用于多个耐药相关蛋白达到逆转多药耐药的作用。目前，中药抗多药耐药的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年来中药在逆转多药耐药的分子水平的研究进展。
1 肿瘤多药耐药经典途径
P-gp蛋白介导的多药耐药是研究最多，机制最为明确的多药耐药产生途径，因此被称为多药耐药的经典途径。由MDR1基因编码的P-gp蛋白ATP依赖性的药物泵，其是通过水解ATP提供的能量，将进入细胞内的药物泵出细胞，使得细胞内药物浓度不断下降，最终使药物细胞毒作用减弱甚至丧失出现耐药［2］。中药下调P-gp蛋白的实验研究较多，下面就分体外与体内实验分别阐述。
1.1 体外实验研究解霞等［3］对川芎嗪(TMP)逆转多药耐药机制的研究显示MCF-7/ADM 细胞P-gp蛋白表达率为(90.60±0.41)％，而加入非细胞毒性剂量川芎嗪后，耐药细胞P-gp的表达率则降为(69.10±1.65)％（P
1.2 体内实验研究李贵海等［6］粉防己碱对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞相关蛋白的调控研究显示单纯应用DDP的模型组，其P-gp蛋白的表达为13.13±5.33，而粉防己碱无毒性高低剂量组其表达分别降为7.41±3.35和9.22±2.36，且其抑制率显著提高，揭示逆转耐药的机制可能与其降低P-gp蛋白的表达有关。
另据实验报道，中药三氧化二砷、ECCG、甲基莲心碱、补骨脂素等也可下调P-gp蛋白的表达而达到逆转多药耐药的作用［7～10］。
2 多药耐药的非经典途径
由MDR1基因编码的P-gp蛋白过度表达介导的药物外排是产生MDR的经典机制，除此外，MDR还与多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白（LRP）、谷胱甘肽S转移酶、拓扑异构酶、细胞凋亡等多种非经典机制密切相关。
2.1 MRP介导的多药耐药多药耐药蛋白1(MRP1)属于ATP结合的盒式(ATP-binding cassette，ABC)运输蛋白家族成员，它可以通过细胞膜转运多种抗肿瘤药，从而限制抗肿瘤药进入细胞［11］。
徐萌等［12］用汉防己甲素逆转肺癌耐药实验研究发现经汉防己甲素处理12，24，36 h后MRP蛋白表达量的表达分别为32.21±4.79，30.56±4.58，25.55±7.58，而对照组则分别为53.42±7.42，52.98±10.35，60.98±9.37，差异有非常显著性意义(P
另外，王利等［14］葛根素逆转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的体内实验研究显示5-FU联合葛根素组MRP蛋白阳性表达率为37.5%，显著低于对照组生理盐水组（82.5%）及单纯5-FU组（74%）（P
2.2 谷胱甘肽介导的多药耐药多药耐药的产生机制复杂多样，其中谷胱甘肽S-转移酶活性的增强是产生多药耐药的重要机制。肖希斌等［15］的研究显示K562/A02细胞GST-π的PCR扩增带亮度较强，而经甲基莲心碱(Nef)处理组PCR扩增带亮度明显减弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST-π基因的mRNA转录，蛋白质印迹检测结果亦显示，未经药物处理的K562/A02组的蛋白杂交带，明显强于K562/A02+Nef组，表明Nef能抑制GST-π蛋白的表达。
苗立云等［16］青蒿琥酯逆转K562/A02细胞耐药性机理的研究显示K562/A02细胞内GSH呈现高表达(P
2.3 核转录因子介导的多药耐药核转录因子（NF-κB）在细胞增殖和凋亡中起关键调控作用，而目前有研究显示其在多药耐药的产生中也扮演着重要的角色，陈进伟等［17］K562/A02耐药细胞NF-κB活性测定的研究发现活化后K562/A02细胞NF-κB表达明显增强(P
2.4 LRP及拓扑异构酶介导的多药耐药肺耐药相关蛋白（LRP）与拓扑异构酶亦是近期研究较多的耐药介导介质。LRP作用机制是通过降低药物的核质分布比率和通过囊泡、胞吐作用将药物排出细胞［19］。拓扑异构酶(TopoⅡ)是调控DNA拓扑状态的酶类，据研究发现，TopoⅡ质和量的改变会直接影响与DNA的结合，导致药物诱导产生的裂解复合物形成减少，从而导致耐药。孙付军等［20］研究发现苦参碱可以逆转小鼠S180肿瘤细胞获得性多药耐药，其研究表明经其诱导后LRP、TOPOⅡ小鼠瘤体中可呈稳定高表达，而给予小鼠100mg/kg苦参碱后的瘤体中两种蛋白的表达率分别降低为（10.76±6.28）%和（8.58±4.1）%，与对照组相比呈现显著性（P
2.5 降低细胞内CA2+浓度Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和传导等机制的信使，自从Tsuruo等初次发现MDR表型的肿瘤细胞内游离Ca2+浓度增高以来，许多实验证明耐药肿瘤细胞中Ca2+浓度高于非耐药肿瘤细胞，又有学者证实钙拮抗剂可逆转细胞对药物的耐药性。蔡宇等［23］补骨脂素对HL60/HT耐药细胞逆转及对细胞内Ca2+浓度影响研究发现耐药株HL60/HT细胞内Ca2+浓度明显高于敏感株HL60(P
2.6 凋亡相关基因介导的多药耐药Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调控物，其中Bcl-2相对分子量为26 000，蛋白水平与肿瘤细胞的MDR相一致，其过表达的肿瘤细胞凋亡受抑制，同时对阿霉素、长春新碱、顺铂等多种化疗药物耐药，其机制可能在于其产物可以稳定细胞生存，抑制多种因素，包括化疗药物诱导的细胞凋亡，从而使细胞产生耐药［25，26］。
艾小红等［27］甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用发现HepG2/thermotolerance细胞较HepG2细胞高表达Bcl-2蛋白，而甲基莲心碱能够下调HepG2/thermotolerance细胞的Bcl-2表达。钟陆行等［28］参芪扶正注射液对K562/ADM多药耐药的影响研究显示K562/ADM 细胞Bcl-2基因呈现高表达，经10 μl/ml参芪处理后其表达为68.39±3.89，而正常对照组则高达(93.82±2.32)，由此可见参芪扶正注射液可以明显下调Bcl-2表达率。
3 多靶点作用逆转机制
整体观念是中医的基本特点之一。从现代研究的角度看，可以体现在中药治疗肿瘤的多靶点作用。在逆转多药耐药中，中药的作用机制也并非只局限于某一点，而是一个综合的作用，这也正是中药在逆转多药耐药研究中越来越受到人们重视的原因之一。
3.1 体外实验研究侯华新等［29］用板蓝根高级不饱和脂肪酸对耐药肝癌细胞株BEL-7404/ADM逆转作用实验发现P-gp、MRP蛋白在Bel-7404/ADM 细胞中呈现高表达（与Bel-7404相比，P
3.2 体内实验研究董琳等［32］甲基莲心碱对胃癌多药耐药的逆转作用研究发现P-gp、MRP在 SGC7901/VCR细胞中呈现高表达（P
4 结论与展望
目前，研究发现多药耐药的产生主要存在以下几个方面的机制：①P-gp蛋白介导的耐药，另多药耐药相关蛋白(MRP)及肺耐药相关蛋白(LRP)的异常表达也受到重视；②酶系统异常，包括GSH，GST，DNA拓扑异构酶(TOPOⅡ)和PKC活性改变；③bc1-2基因高表达是抑制肿瘤细胞凋亡、导致肿瘤耐药的重要因素。而综合国内文献发现，中药对多药耐药的逆转作用亦是多渠道、多途径的，往往也是通过对不同耐药途径的综合调控作用而实现的。
不过，我们通过对近几年的文献研究可以发现中药在逆转多药耐药研究中亦存在一定的问题，其主要体现在以下几个方面：①研究多偏重于单体，而对复方研究较少，难以体现中医辨证施治的特点；②对机制的研究多偏重于经典途径，而对非经典途径研究相对较少；③中药对多药耐药的逆转作用往往是多方面的，而有些文献报道多只对单个耐药相关蛋白表达进行研究，不免存在以偏概全之嫌；④亟需探索中药研究的新方法，从而来弥补中药成分复杂给实验带来不稳定性。
总之，通过对近5年的相关文献分析，我们发现中药在逆转多药耐药的研究中已深入到分子生物学水平。其逆转作用往往是通过对不同的耐药蛋白的综合作用而实现的。由于中药成分的不单一性，使其作用往往不局限于某单一靶点，而是体现于多个靶点。其是通过多靶点的综合作用，从而可以从多角度、多层次来发挥逆转多药耐药的作用，另外中药体现出了毒副作用小，作用显著的优点而愈加受到国内外学者的关注。中药逆转剂的进一步研究推广势必有益于化疗疗效的提高和晚期癌症患者的生活质量的改善。
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非酒精性脂肪性肝病 (nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是以无过量饮酒史(酒精摄入量＜20 g/d)以及肝细胞脂肪变性、气球样变、弥散性肝小叶轻度炎症和(或)肝中央静脉、肝窦周围胶原沉积等为临床病理特点的慢性肝脏疾病［1］，它包括单纯性脂肪肝 (nonalcoholic fatty liver，NAFL)、脂肪性肝炎(nonalcohlic steatohepatitis，NASH)、脂肪性肝硬化(fatty liver cirrhosis，FLC)三种类型。NAFLD已成为导致转氨酶异常的首要病因，并且有部分患者进展到终末期肝病，部分患者甚至与肝脏肿瘤有关。目前我地区NAFLD的发病正在逐渐上升［2］，本病的发病原因尚不完全清楚，认为其发生与胰岛素抵抗、氧应激反应和脂质过氧化物质的代谢失衡有关［3］。本文就该病近几年来其分子生物学方面的一些研究进展综述如下。
1.氧自由基对肝细胞的损害作用
患者由于甘油三脂在肝细胞内蓄积，大量的游离脂肪酸（FFA）在线粒体内氧化，产生了过多的超氧阴离子和活性氧物质 (reactive oxygen species，ROS)，使抗氧化物质耗竭，过量的过氧化氢 (H2O2)和氢氧根离子 (OH)损伤肝脏细胞的线粒体和细胞膜，使肝细胞正常生长停滞，炎症变性，最终导致肝细胞变性坏死而引起临床症状［4］。氧是生物维持活性的必要元素，但其在代谢过程中形成的中间产物ROS，与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多价不饱和脂肪酸及核酸等大分子物质发生脂质过氧化反应，结果使细胞膜的流动性和通透性发生障碍，引起细胞功能失调甚至破裂、死亡。机体在正常生理状态下，具有完善的抗氧化机制，包括超氧化物歧化酶(SOD)等酶类和谷胱甘肽(GSH)等非酶类活性氧清除剂。现代研究认为，活性氧增多和活性氧清除剂减少是NAFLD的重要发病机制［5］。线粒体是脂肪酸进行β氧化和三羧酸循环、ATP合成和ROS形成的主要场所，线粒体在氧化脂肪和其他燃料供给大多数细胞 ATP时，快速形成 ROS，尽管在这一过程中部分电子可与呼吸链上的半醌自由基反应形成超氧阴离子(O2)、过氧化氢 (H2O2 )和氢氧根离子 (OH)等氧自由基，其中超氧阴离子是最重要的毒性氧类产物，但细胞内的抗氧化剂可以清除之，避免其所致的氧化应激和脂质过氧化［7］。线粒体是 ROS形成的主要部位，线粒体电子转运系统可消耗细胞90％的氧。大量的ROS可直接或间接通过改变线粒体膜通透性转变孔 (MPTP)的开关，导致细胞凋亡和坏死［8］。 ROS可氧化不饱和脂肪酸导致脂质过氧化，所形成的脂质过氧化物 (LPO)可使部分非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者发生 mtRNA缺失、复制错误、修复障碍和断裂，并造成其呼吸链复合物活性降低［4］。DNA对氧应激很敏感，线粒体的DNA(mtRNA)的氧化损伤敏感性比核DNA高达10～16倍，这是由于mtRNA缺乏组蛋白保护、线粒体修复程序不完整以及 mtRNA相似呼吸链(该链是细胞内 ROS的主要来源)的缺乏［6］。研究发现，大部分NAFLD患者的大部分肝脏 mtRNA均有缺损，造成呼吸链复合物活性降低，同时，线粒体缺乏过氧化氢酶，该酶是唯一作用于GSH过氧化氢毒性作用的酶，线粒体不仅是氧应激的源头，而且是 ROS作用的靶，大量的ROS促成线粒体功能障碍［8］。LPO还可与线粒体蛋白反应形成复合物，抑制电子沿着呼吸链的传递，使氧自由基形成显著增多，进而加重线粒体损伤［6］。
2.肿瘤坏死因子(TNFα) 与NAFLD
机体的氧应激反应产生过多的TNFα可以诱导肝脏成纤维细胞、平滑肌细胞、血管内皮细胞、粒细胞和巨噬细胞产生集落刺激因子(GMCSF)，从而影响机体的炎症反应和脂质代谢［9］。TNFα与早期非酒精性脂肪性肝病损伤有密切关系。有报道，NAFLD患者循环中TNFα水平增高，且TNFα与肝脏损伤的生化指数相关［10］。人们应用逆转录聚合酶链反应在大鼠非酒精性肝病模型的研究中发现，肝内TNFα mRNA增高的水平与肝脏病理损伤的程度相关，同时发现，抗TNFα抗体可以明显减轻非酒精性脂肪性肝病大鼠的肝脏炎症和肝细胞坏死病变，但对肝脂肪变性无影响［11］。对离体人肝胚细胞瘤细胞进行细胞毒性实验发现，TNFα可以使该细胞生存力下降，这种作用与TNFα抗体引起细胞凋亡有关，抗TNFα抗体可以减轻TNFα的细胞毒性作用［12］。以上研究说明，TNFα在NAFLD的发病中起一定作用。
3.白介素(Interleuldn，IL) 与NAFLD
近年来有研究表明，不同的枯否氏细胞的功能状态可加重或减轻NAFLD的肝损伤，因此认为其在NAFLD的发病中起重要作用，为此，枯否氏细胞的功能状态在NASH发病机制中的作用也日益受到关注。人们发现NAFLD不但循环中 ILla和 IL6水平显著增高，而且两者的浓度与肝脏损伤的严重程度呈高度相关趋势［13］。采用逆转录聚合酶链反应研究发现，给大鼠过量的脂肪灌胃2周或 4周，其肝脏内 ILla mRNA水平增高。喂饲过量的脂肪16周的大鼠肝内枯否氏细胞产生的 IL6 mRNA水平较对照组增加4倍。因此认为NAFLD中ILla和IL6的增高可能与 ILla、IL6转录水平增高有关［14］。IL6可以刺激培养的人皮肤纤维母细胞合成胶原。有人发现，枯否氏细胞 IL6 mRNA表达的增高与NAFLD纤维化形成有关，提示NAFLD中枯否氏细胞起源程序 IL6可能有促进胶原形成的作用［13］。另外，离体的 ILla、IL6细胞毒性实验发现，单独或联合将 ILla或(和)IL6作用于肝炎细胞不会引起细胞毒性反应［14］。目前，关于 ILla、IL6在NAFLD发病中的作用途径还在研究中。
4.转化生长因子β(TGFβ)与NAFLD
TGFβ广泛存在于哺育动物所有组织中，以血小板和骨组织中表达水平最高。在人体内存在 TGFβ1、2、3三种异构体。TGFβ起着调节细胞生长和分化的作用［15］。NAFLD患者，肝内TGFβ主要来源于枯否氏细胞。目前认为，TGFβ在NAFLD的主要作用是通过诱导细胞外基质的形成，抑制细胞外基质降解，导致肝纤维化形成［16］。从脂肪性肝纤维化大鼠肝脏分离得到的枯否氏细胞作用于肝星状细胞，可以发现肝星状细胞产生胶原。为了进一步证实TGFβ的作用，将抗TGFβ IgG预先与枯否氏细胞一起培养，然后去除多余的IgG，此时枯否氏细胞刺激肝星状细胞产生胶原的作用被抑制，表明脂肪性肝损伤中枯否细胞产生TGFβ是促进胶原形成的重要细胞因子［17］。另外，离体培养的肝窦内皮细胞上的受体可与TGFβ快速结合。肝窦内皮细胞上这种高亲和力受体的存在可能是TGFβ作用的重要途径［18］。研究显示，增殖细胞核抗原(PCNA)单克隆抗体，停滞于G1／S期的肝窦内皮细胞数量与NAFLD的严重程度明显相关。TGFβ通过与肝窦内皮细胞受体结合抑制其增殖，使其分化为平滑肌样细胞，后者在肝纤维化中起一定的作用。肝窦内皮细胞增殖抑制还可能通过产生另一些中间介质刺激肝星状细胞分泌细胞外基质。人体内三种形式的TGFβ在NAFLD中均增高，并且随病变严重程度而增加，其mRNA表达水平明显增高。肝内TGFβ二聚体具有生物活性，还原剂可使二聚体分离，活性完全丧失，酸性微环境对于激活TGFβ有着重要意义。枯否氏细胞可能首先分泌非活性TGFβ，后者在细胞外或靶细胞表面激活，转化为活性形式的TGFβ而发挥作用［19］。
此外，本病还受遗传、环境、免疫和药物等因素影响，总之，NAFLD的发病机制具有多样性，仍有广阔的研究空间。我们坚信随着对本病研究的不断深入，其发病机制将会得到进一步的阐明，并为其有效的防治提供措施。
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